李靖霄，李国盛，徐阳，何融泉，周华富，孔晋亮，陈罡*
肺癌（lung cancer，LC）是中国最常见且病死率最高的癌种；
最新的研究报道显示，在世界范围内的恶性肿瘤中，LC的发病率和病死率分别位居第二和第一［1，2］。根据病理分型，LC常被分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）两种亚型，而前者约占LC的85%［3］。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）是最常被诊断的NSCLC组织学亚型［4］。随着诊断和治疗技术的进步，手术联合新型放化疗已可使NSCLC患者5年生存率达到21.7%［5］。然而，更多的患者在确诊时肿瘤已进展到晚期，这让常规治疗方法的疗效不容乐观［6，7］。因此，挖掘有效的临床筛查和治疗NSCLC的标志物，对降低患者病死率和提高患者生存质量尤为重要。
微小RNA（microRNAs，miRNAs）可通过调控信使RNA的表达而影响转录过程［8］。作为miR-130家族的一员，miR-130b-3p已被报道参与调控多种肿瘤的进展，但其调控作用与调控机制在不同肿瘤中却不尽相同［9］。例如，miR-130b-3p在肝细胞癌、乳腺癌、前列腺癌中被认为具有抑制肿瘤发展的作用，而在膀胱癌、肾母细胞癌、胃癌中被认为具有促进肿瘤发展的作用［10-15］。此外，miR-130b-3p在NSCLC中的作用也已被初步报道。一些针对人工培育NSCLC细胞和NSCLC患者肿瘤组织的研究表明，miR-130b-3p具有促进癌细胞增殖、侵袭和转移的作用［16-18］。尽管Ulivi等人的研究提到，血液中miR-130b-3p的表达与NSCLC患者的总生存率显著相关，但他们并未阐明miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表达情况与临床意义［18］。此外，这些有关miR-130b-3p和NSCLC的研究均属于单中心的小样本研究，未探索miR-130b-3p应用于筛查NSCLC的潜在价值，且未阐明miR-130b-3p在NSCLC中的作用机制。因此，应用大量样本进一步探索miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表达水平和作用机制对明确miR-130b-3p的潜在临床应用价值至关重要。
本研究旨在通过分析来自公共数据库的miRNAs表达谱，以探究miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表达水平及鉴别该疾病的潜力，从而挖掘miR-130b-3p筛查和治疗NSCLC的潜在临床意义。
1.1 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表达水平
为采集用于分析miR-130b-3p在NSCLC中的表达水平与鉴别潜力的数据，本研究以“lung AND（tumor OR cancer OR carcinoma OR neoplasms）
AND（microRNA OR miRNA）”作为检索式，在基因表达谱数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）以及序列片段归档数据库（Sequence Read Archive，SRA）中进行检索。同时，为了检索与提取癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中收录的数据，Xena数据库被用于下载LC相关数据集。数据集纳入条件如下：①研究对象为智人；
②数据应来自血液，包括全血、血浆等；
③数据集需包含miR-130b-3p表达数据；
④每个数据集需包含至少3个肿瘤和3个非肿瘤样本；
⑤样本未经过任何药物或其它化学物质处理。随后，将所收集到的数据按照测序平台进行合并，并进行了log2（x+1）转换。
为观察不同NSCLC亚型中miR-130b-3p的表达水平，本研究根据肿瘤亚型将所有样本分为两组，分别为LUAD和LUSC组。首先，对数据集的平均值、标准差、敏感度、特异度进行计算，并根据分组进行记录。接着，各个数据集的miR-130b-3p表达水平被绘制成散点图和受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线。为了综合展示各个数据集的结果，标准化均数差（standardized mean difference，SMD）和诊断性似然比（diagnostic likelihood ratio，DLR）也被计算。我们还绘制森林图与综合受试者工作特征（summaryreceiver operating characteristic，sROC）曲线。由于可收集到的数据有限，本研究在此将LUAD和LUSC的数据集合并分析。曲线下面积（area under curve，AUC）的百分比值大小是在ROC及sROC曲线中评判miR-130b-3p鉴别NSCLC的潜力的标准。
1.2 MiR-130b-3p下游靶基因的筛选
MiRwalk 2.0纳入了12个数据库的miRNAs和基因的表达情况，具有预测miRNA-靶基因关系的功能。本研究将“miR-130b-3p”作为关键词在MiRwalk 2.0中进行检索。对检索到的靶基因基于下列条件筛选：结合分数（binding score）等于1且同时在12个数据集中被认为是miR-130b-3p的靶基因。将筛选到的基因输入检索相互作用基因的搜索工具（search tool for the retrieval of interacting genes，STRING）分析靶基因之间作用关系，并构建蛋白质-蛋白质交互（protein-protein interaction，PPI）网络。随后，根据各基因相互作用的degree值筛选出的枢纽基因（hub genes）被选用于后续分析。
1.3 富集分析
将筛选得到的miR-130b-3p下游靶基因输入注释、可视化和集成发现数据库（database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID）v 6.8进行富集分析。本研究选择了基因本体（Gene Ontology，GO）-生物过程（biological process，BP）、GO-细胞成分（cellular component，CC）、GO-分子功能（molecular function，MF）对miR-130b-3p下游靶基因进行功能富集，同时应用京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，以探讨miR-130b-3p下游靶基因调控肿瘤发展的潜在信号通路。
1.4 数据分析
在本研究中，Graphpad prism 8.0被用于构建散点图及描绘ROC曲线。应用IBM SPSS 23.0计算数据平均值和标准差。Stata 14.0被用于计算SMD和DLR并绘制森林图与sROC曲线。在线数据库miRwalk 2.0以及DAVID v6.8分别被用于预测miR-130b-3p的下游靶基因和下游靶基因的潜在信号通路。我们使用Cytoscape v3.7.1的cytohubba模块筛选出了miR-130b-3p下游靶基因的枢纽基因。
2.1 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中低表达
在本研究中，共有来自公共数据库的7项研究被纳入分析（表1）。
在4个纳入的LUAD数据集中，有3个表明miR-130b-3p在LUAD组和对照组血液样本间的表达差异被认为具有统计学意义（P＜0.05）（图1A～D）。如 图1E～G所 示，在3个 纳 入 的LUSC数据 集 中有1个表明在LUSC组和对照组血液样本间miR-130b-3p的表达差异被认为具有统计学意义（P＜0.05）。根据各个数据集ROC曲线的AUC，我们认为使用在NSCLC患者血液中低表达的miR-130b-3p具有良好的预测价值（图2）。
图1 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中表达水平的散点图A～D：样本来自LUAD患者血液；
E～G：样本来自LUSC患者血液
图2 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中的ROC曲线A～D：分别为GSE27486、GSE40738、GSE152702和GSE171517的ROC曲线；
E～G：分别为GSE40738、GSE152702和GSE171517的ROC曲线
为了进一步明确miR-130b-3p在NSCLC患者血液的表达水平，本研究综合计算了miR-130b-3p的SMD（表2）。结果表明，在LUAD中，SMD=-1.45，95%置信区间（confidence interval，CI）为-2.66～-0.23；
在LUSC中，SMD=-0.46，95%CI：-0.84～-0.09（图3A）。未发现SMD结果存在明显的发表偏倚（图3B）。因此，目前结果显示miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表达量显著低于健康人血液。综合结果，我们发现在NSCLC患者血液中低表达的miR-130b-3p具有较好地区分肿瘤组织和正常组织的潜力（AUC=0.85，95%CI：0.82～0.88）（图3C）。图3D提示纳入的NSCLC组织数据集具有较低的阴性DLR以及较高的阳性DLR。
图3 MiR-130b-3p在NSCLC患者体内的表达水平及鉴别潜力A：MiR-130b-3p在血液中表达水平森林图，上半部分表示其在LUAD血液样本中的表达水平，下半部分表示其在LUSC血液样本中的表达；
B：漏斗图展示所纳入血液样本的发表偏倚；
C：MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中的sROC曲线；
D：在NSCLC患者血液中miR-130b-3p的DLR注：LUAD，肺腺癌；
LUSC，肺鳞状细胞癌；
sROC，综合受试者工作特征；
NSCLC，非小细胞肺癌；
DLR，诊断性似然比
表2 在7项纳入的研究中，miR-130b-3p在NSCLC患者和健康人血液中的表达水平平均值与标准差
2.2 探索miR-130b-3p的下游靶基因
在miRwalk 2.0中，本研究筛选出了47个miR-130b-3p的下游靶基因，并通过PPI网络展示了他们之间的联系（图4A）。根据各下游靶基因间的degree值，我们筛选出了前10个degree值最高的下游靶基因作为枢纽基因，分别为ESR1、AGO1、DDX6、MTMR9、CFL2、TRIM2、QKI、FMR1、TNRC6B和BRWD1（图4B）。所筛选出的下游靶基因们将被用于后续分析。
2.3 富集分析
结果显示，在GO-BP分析中，miR-130b-3p下游靶基因显著富集于protein phosphorylation、mRNA processing和RNA splicing（图4C）。在GO-CC分析中，miR-130b-3p下游靶基因显著富集于lysosome、early endosome membrane和processing body（图4D）。在GO-MF分析中，miR-130b-3p下游靶基因显著富集于protein binding、chromatin binding和protein serine（图4E）。KEGG分析结果表明，miR-130b-3p下游靶基因显著富集于endocytosis和axon guidance通路（图4F）。这些结果提示miR-130b-3p可能通过参与相关通路的调控进而影响NSCLC的发展。
图4 MiR-130b-3p下游靶基因的富集分析A：使用miR-130b-3p下游靶基因构建的PPI网络图；
B：MiR-130b-3p下游靶基因的枢纽基因（hub genes）；
C：在GO_BP分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情况；
D：在GO_CC分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情况；
E：在GO_MF分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情况；
F：在KEGG富集分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情况
在本研究中，基于300例血液样本的miR-130b-3p表达水平，我们首次提出miR-130b-3p在NSCLC患者血液中表达下调。同时，我们发现在血液中低表达的miR-130b-3p具有显著的筛查NSCLC患者的潜力。47个基因被鉴定为miR-130b-3p的下游靶基因，且根据这些靶基因探索miR-130b-3p参与调控NSCLC发生发展的潜在信号通路。
近年来，已有一些研究报道了miR-130b-3p在NSCLC中的表达水平及生物学作用。基于分析55例组织样本，Yu等［16］人发现miR-130b-3p的表达水平在来自NSCLC患者体内的癌细胞中明显升高，并与肿瘤细胞的增殖和转移速度呈正相关，且敲低miR-130b-3p后，肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移随之受到抑制。Guo等［17］人发现miR-130b-3p在人工培育的NSCLC细胞中表达上调；
而敲低miR-130b-3p的NSCLC细胞具有更低的增殖、侵袭和迁移能力，提示了miR-130b-3p表达可能影响NSCLC的进展。通过分析99例LUAD样本和83例LUSC样本的血液miRNAs表达水平，Ulivi等［18］人报道了高表达的miR-130b-3p与LUSC患者的无瘤生存期呈明显负相关，且与LUAD患者的总生存率呈明显负相关。这些研究提示了miR-130b-3p在NSCLC的表达差异及重要生物学功能，但存在样本量较小（n≤182）、仅基于单中心数据等问题，他们也并未阐明miR-130b-3p在血液中的表达水平。在本研究首次通过来自公共数据库大样本探讨了miR-130b-3p在NSCLC患者血液内的表达水平，并发现相较于健康人的血液，miR-130b-3p在NSCLC患者的血液中呈现明显的低表达。已有的研究认为，细胞凋亡和活性分泌是血液中miRNAs的重要来源，当细胞凋亡和活性分泌活跃时，血液中miRNAs含 量 上调［19］。Guo等［17］人认为，miR-130b-3p主要来自间充质干细胞，并通过胞外囊泡分泌转移至NSCLC细胞内，从而促进NSCLC细胞的增殖、侵袭和转移。因此，我们推断NSCLC患者间充质干细胞分泌的miR-130b-3p随血液转移至NSCLC细胞内，导致患者血液中miR-130b-3p含量较正常人的更低；
同时，由于肿瘤细胞凋亡活动减弱，患者血液中miR-130b-3p将持续处于低水平。
现有研究表明，血液中miRNAs可作为某些肿瘤的生物标志物［20］。一些研究也通过诊断试验鉴定了多个具有作为NSCLC早期筛查的生物标志物前景的miRNAs［21-23］。在本研究中，诊断试验结果显示miR-130b-3p的AUC=0.85，提示miR-130b-3p可以较为准确地鉴别NSCLC患者和健康人。因此，我们提出通过检测血液中miR-130b-3p的表达水平，有助于筛查NSCLC。在未来投入更多的精力研究miR-130b-3p在NSCLC患者血液的表达水平，对早期预测NSCLC及其预后具有积极作用。
本研究尚存在一些局限：首先，尚需在将来经过实验验证miR-130b-3p与下游靶基因的联系；
其次，下游靶基因所显著富集的信号通路与NSCLC发展的关系尚无法阐明；
最后，因可收集的样本有限，除了LUAD和LUSC外，本研究未能对NSCLC的其他亚型进行分析。
总之，本研究通过分析来自多中心的大样本数据，首次提出miR-130b-3p在NSCLC患者血液内表达下调，并有望用于NSCLC的筛查。
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