乌吉斯古楞，张文华，张彤
肝癌是全球范围内最常见的致命恶性肿瘤，发病率逐年增加，在发展中国家发病率较高[1-2]。探究肝癌的发病机制，并寻找分子靶向药物已成为当前的研究热点。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可在肝脏微环境和慢性肝脏疾病的调节中发挥关键作用，能够调节免疫反应、肝脏再生和氧化还原信号，lncRNA失调可导致慢性肝炎、肝脏增生和氧化应激，最终导致肝癌的发生和进展[3]。长链非编码RNA酪氨酸蛋白激酶跨膜受体1反义RNA 1(tyrosine protein kinase transmembrane receptor 1 antisense RNA 1，ROR1-AS1)在肝细胞癌中表达上调，且与患者临床分期、T分期及N分期有关，ROR1-AS1高表达与不良预后有关[4]。但ROR1-AS1对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的调控机制尚不清晰。微小RNA-504(microRNA-504，miR-504)在肝细胞癌组织和细胞系中下调，miR-504通过介导FZD7/Wnt/β-catenin通路在肝癌中发挥抑癌作用[5]。基于上述研究推测ROR1-AS1可能通过靶向miR-504参与肝癌疾病进展，本研究对此展开探讨，报道如下。
1.1 材料 (1)组织标本：选取2019年6月—2021年5月于内蒙古医科大学附属医院肝胆外科收治肝癌患者32例，患者均无放、化疗史。术中收集患者癌组织及癌旁组织(距手术切缘≥3 cm，病理检测证实无癌细胞)标本。本项研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》，且经医院伦理委员会审核、批准(20190711)，患者及家属知情同意并签署知情同意书。(2)细胞系及试剂：人肝细胞癌MHCC97H细胞株(中国科学院上海细胞生物学研究所)；
si-NC、si-ROR1-AS1、miR-NC、miR-504 mimics、anti-miR-NC及anti-miR-504质粒均由上海吉玛制药技术有限公司提供；
三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(p21)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、MMP-9、上皮型钙黏附素(E-cadherin)兔单克隆抗体及Luciferase Reporter Assay底物试剂盒均由英国Abcam公司提供；
LipofectamineTM2000试剂盒、Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；
逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)。(3)仪器设备：显微镜(GMM-900，上海光密仪器有限公司)；
酶标仪(SpectraMax iD5，上海美谷分子仪器有限公司)。
1.2 实验方法 采用RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)，在97%湿度、5%CO2、37℃环境下培养MHCC97H细胞。培养基每2～3 d更换1次，当细胞汇合度至80%～90%时，胰蛋白酶消化后传代。将对数期MHCC97H细胞接种于6孔板，密度调整至1×105个/孔，细胞汇合度达60%时，分别将si-ROR1-AS1、si-NC、miR-504 mimics、miR-NC、si-ROR1-AS1和anti-miR-504、si-ROR1-AS1和anti-miR-NC转染至MHCC97H细胞，记为si-ROR1-AS1组、si-NC组、miR-504 mimics组、miR-NC组、si-ROR1-AS1+anti-miR-504组及si-ROR1-AS1+anti-miR-NC组，采用LipofectamineTM2000试剂盒进行转染。24 h后更换培养基，继续培养24 h，收集细胞备用。
1.3 观测指标与方法
1.3.1 qRT-PCR检测ROR1-AS1、miR-504表达：将患者癌组织、癌旁组织标本移植于液氮预冷的研钵体中，研磨成粉末状，并收集人肝细胞癌MHCC97H细胞，经PBS清洗后，分别加入TRIzol试剂1 ml，然后上下翻动细胞、组织粉末，以保证混合均匀后，静置10 min，使核酸蛋白复合物完全分离。分别再加入氯仿、异丙醇，翻动混匀后静置5 min，离心吸取上清液于EP管中，留取RNA沉淀，最后提取MHCC97H细胞及患者癌组织、癌旁组织样本中总RNA，并检测其纯度和浓度，然后按逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA，并采用荧光定量PCR试剂盒和PCR仪进行PCR反应，反应体系：cDNA 1 μl、SYBR Green Mix 10 μl、上下游引物各0.5 μl、ddH2O 8 μl。反应条件：95℃ 10 min、95℃ 15 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，共计30个循环。于荧光定量PCR仪上扩展，2-△△Ct法计算ROR1-AS1、miR-504的相对表达量。引物序列见表1。
表1 ROR1-AS1、miR-504及相应内参GAPDH、U6的引物序列
1.3.2 细胞克隆形成实验：将转染相应质粒后的各组MHCC97H细胞接种于6孔板(5 000个/孔)，培养基每2 d更换1次。培养14 d后，甲醛固定30 min，结晶紫染色1 h并风干。于显微镜下观察并记录细胞克隆数。
1.3.3 MTT法检测细胞增殖：将转染相应质粒后的各组MHCC97H细胞接种于96孔板(2.5×104个/孔)，培养24 h，加入MTT(5 g/L)20 μl，孵育4 h，加入二甲基亚砜150 μl，低速震荡，于酶标仪490 nm处测定吸光度值(A)，计算细胞存活率=A实验组/A对照组×100%。
1.3.4 Transwell检测细胞迁移、侵袭：向各组细胞中加入RPMI 1640培养基(不含胎牛血清)，并调整细胞浓度为5×104个/ml。迁移实验：取上述细胞悬液100 μl加入Transwell小室上室中，RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)500 μl加入下室。培养48 h，经多聚甲醛固定、结晶紫染色后，倒置显微镜下观察、计数。侵袭实验：采用RPMI 1640培养基稀释预冷的Matrigel基质胶(8∶1)，并铺于Transwell上室，晾干后加入上述细胞悬液100 μl。后续步骤与迁移实验相同。
1.3.5 Western-blot法检测MMP-2、MMP-9、p21及E-cadherin蛋白表达:RIPA试剂提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定蛋白浓度。将蛋白煮沸使其变性，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，各泳道上样量为30 μg。蛋白分离后，移至聚偏(二)氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，洗膜，分别置于MMP-2、MMP-9、p21、E-cadherin抗体孵育液中，4℃过夜。再加入二抗孵育液，37℃孵育2 h。ECL显影，Quantity One凝胶软件分析结果。
1.3.6 双荧光素酶报告实验验证ROR1-AS1与miR-504的靶向关系:Starbase数据库预测ROR1-AS1、miR-504是否存在结合位点。根据ROR1-AS1、miR-504结合区域序列，构建ROR1-AS1野生型(WT)及突变型(MUT)质粒，并分别转染miR-504 mimics、miR-NC，培养48 h后，检测荧光素酶活性。
2.1 肝癌组织与癌旁组织ROR1-AS1、miR-504的表达比较 肝癌患者癌组织中ROR1-AS1水平高于癌旁组织(P<0.01)，miR-504水平低于癌旁组织(P<0.01)，见表2。
表2 肝癌组织及癌旁组织中ROR1-AS1、miR-504表达比较
2.2 抑制ROR1-AS1对MHCC97H细胞增殖、迁移、侵袭及蛋白的影响 与si-NC组比较，si-ROR1-AS1组ROR1-AS1水平、克隆形成数、细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9蛋白水平下降(P<0.01)，miR-504、p21蛋白、E-cadherin蛋白水平升高(P<0.01)，见图1、2，表3、4。
表3 抑制ROR1-AS1对MHCC97H细胞增殖、迁移、侵袭的影响
图1 各组MHCC97H细胞克隆形成、迁移、侵袭情况比较(结晶紫染色，×200)
注:A.si-NC组;B.si-ROR1-AS1组;C.miR-NC组;D.miR-504 mimics组;E.si-ROR1-AS1+anti-miR-NC组;F.si-ROR1-AS1+anti-miR-504组
2.3 过表达miR-504对MHCC97H细胞增殖、迁移、侵袭的影响 与miR-NC组比较，miR-504 mimics组MHCC97H细胞的克隆形成数、细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低(P<0.01)，miR-504、p21蛋白、E-cadherin蛋白水平增高(P<0.01)，见图1、2，表5。
表4 抑制ROR1-AS1对MHCC97H细胞增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达的影响
表5 过表达miR-504对MHCC97H细胞增殖、迁移、侵袭及相关蛋白的影响
2.4 ROR1-AS1靶向调控miR-504表达 Starbase数据库预测，ROR1-AS1与miR-504存在互补序列，见图3。双荧光素酶报告结果显示，与共转染WT-ROR1-AS1和miR-NC比较，共转染WT-ROR1-AS1和miR-504 mimics的荧光素酶活性降低(P<0.01)，见表6。
图3 ROR1-AS1与miR-504的靶向序列预测
表6 2组细胞荧光素酶活性比较
2.5 干扰miR-504表达逆转ROR1-AS1对MHCC97H细胞增殖、迁移、侵袭及相关蛋白表达的作用 与si-ROR1-AS1+anti-miR-NC组比较，si-ROR1-AS1+anti-miR-504组细胞克隆形成数、细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数及MMP-2、MMP-9水平升高(P<0.01)，miR-504、p21蛋白、E-cadherin蛋白水平下降(P<0.01)，见图1、2,表7。
表7 干扰miR-504表达逆转ROR1-AS1对MHCC97H细胞增殖、迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响
肝癌中异常表达的lncRNA对miRNA、mRNA和蛋白质发挥多效作用，通过改变miRNA、mRNA的表达和稳定性，以及影响蛋白质表达、结构、降解或与转录调节因子的相互作用来影响多种癌症表型[6]。因此，探究lncRNA在肝癌中的分子机制，可为肝癌的靶向治疗提供新的方向。ROR1-AS1是近年来发现的lncRNA，主要位于细胞核中，可能参与基因转录的表观遗传调控过程，首次在套细胞淋巴瘤中被发现，可通过与EZH2和SUZ12相互作用发挥致癌作用[7]。Wang等[8]研究发现，ROR1-AS1在结肠癌组织或细胞系中均高表达，具有增强细胞增殖、加速细胞周期、抑制细胞凋亡的作用，可能通过与EZH2结合下调DUSP5影响结肠癌的发生发展。本研究结果显示，ROR1-AS1在肝癌组织中表达增高，提示ROR1-AS1在肝癌进展中可能起促进作用。此外，干扰ROR1-AS1表达后，MHCC97H细胞的克隆形成数、细胞存活率、迁移及侵袭细胞数降低，提示干扰ROR1-AS1表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。MMP-2、MMP-9可参与细胞外基质、基底膜降解过程，对细胞迁移、侵袭具有促进作用[9]。p21能够参与调控细胞周期，发挥肿瘤抑制作用，其高表达可抑制细胞增殖[10]。E-cadherin表达下降可降低细胞间的黏附作用，从而导致细胞脱落、迁移[11]。本研究结果显示，与si-NC组比较，si-ROR1-AS1组MMP-2、MMP-9蛋白水平下降，p21、E-cadherin蛋白水平升高，提示干扰ROR1-AS1表达可能通过调控MMP-2、MMP-9、p21、E-cadherin蛋白水平从而抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭。
lncRNA可充当miRNA“海绵”，抑制miRNA表达，并通过转录因子或修饰酶复合物调节基因转录[12-15]。通过搜索Starbase数据库发现，miR-504可能是ROR1-AS1的靶基因。此外，ROR1-AS1过表达可诱导骨肉瘤MG-63细胞迁移，促进N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达，抑制E-钙黏蛋白的表达。双荧光素酶测定证明，ROR1-AS1与miR-504存在靶向关系，ROR1-AS1过表达可抑制MG-63细胞中miR-504的表达，miR-504过表达可消除ROR1-AS1对骨肉瘤细胞迁移和增殖的部分影响[16]。本研究亦通过双荧光素酶实验验证，miR-504是ROR1-AS1的靶基因。miR-504在胃癌组织中高表达，可通过靶向RBM4促进胃癌细胞增殖、抑制细胞凋亡[17]；
miR-504过表达可抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移、侵袭、上皮间质转化等恶性行为，miR-504低表达与患者间充质亚型转变及较差的生存期有关[18]。以上研究显示，miR-504可在多种恶性肿瘤中发挥不同作用。本研究结果显示，肝癌组织中miR-504表达下调，提示miR-504在肝癌中发挥抑癌作用。同时，过表达miR-504可抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力，并下调MMP-2、MMP-9蛋白表达，上调p21、E-cadherin蛋白表达，再次证明miR-504的抗肝癌作用，且这种抗癌作用可能与调控相关蛋白表达有关。此外，沉默ROR1-AS1可导致miR-504表达升高，而抑制miR-504表达可减弱沉默ROR1-AS1对MHCC97H细胞增殖、迁移、侵袭的影响，进一步证实miR-504是ROR1-AS1的靶基因。
综上所述，ROR1-AS1在肝癌组织中表达上调，抑制ROR1-AS1表达可能通过靶向miR-504抑制肝癌MHCC97H细胞的增殖、迁移及侵袭。
利益冲突：所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明
乌吉斯古楞：课题实验设计，实施研究过程，论文审核；
张文华：分析实验数据，论文撰写；
张彤：论文终审，论文撰写