牛露霏 张艳 王如意
摘要：目的通過网络药理学方法和分子对接试验来探讨补肾活血复方治疗心绞痛的有效成分、作用靶点及作用通路。方法首先利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）查找补肾活血复方的药物成分和药物靶点，并使用UniProt数据库对检索的药物靶点进行过滤筛选。然后通过GeneCards数据库、pharmGKB数据库、TTD数据库、Drugbank数据库检索来得到心绞痛的疾病靶点。最后将补肾活血复方的药物靶点与心绞痛的疾病靶点取交集，从而得到补肾活血复方治疗冠心病的作用靶点。利用Cytoscape3.9.0软件，构建“药物成分—作用靶点”网络关系图。在String网站绘制蛋白互作网络（PPI）并利用Cytoscape3.9.0软件联合R软件筛选PPI网络核心。对作用靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析。之后通过AutoDock 软件完成分子对接验证，在 Pymol 软件中绘制可视化分子对接图。结果得到补肾活血复方治疗心绞痛的入血成分109个，其中槲皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素为关键成分。药物—疾病交集靶点149个。对交集靶点GO富集结果显示，生物过程（BP）主要涉及到主要条目包括对氧气水平的反应、脂多糖的反应、对营养水平的反应、对氧化应激的反应、对细菌来源分子的反应等。得到细胞组分（CC）99条，主要条目包括薄膜阀、膜微区、水泡腔、质膜外侧、分泌颗粒管腔等。得到分子功能（MF）195条，主要条目包括DNA转录结合因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、核受体活性、配体激活的转录因子活、儿茶酚胺结合性等方面。KEGG分析主要富集在脂质与动脉粥样硬化通路。分子对接试验显示，关键活性成分与核心靶点通过氢键相链接，能够形成稳定的空间结构。结论网络药理学和分子对接结果表明补肾活血复方治疗心绞痛的机制在于应用槲皮素、木犀草素、山奈酚、黄芩素等活性成分，以AKT1、MKPT1等为关键靶点，通过脂质和动脉粥样硬化通路、糖尿病并发症中的衰老信号通路等通路来发挥治疗作用，为深入探究补肾活血复方治疗心绞痛的作用机制提供了依据和参考。
关键词：补肾活血复方；
心绞痛；
网络药理学；
分子对接
中图分类号：R541.1文献标志码：A文章编号：1007-2349（2023）05-0023-09
Exploration of the Mechanism of Bushenhuoxue Compound in the Treatment of
Angina Pectoris Based on Network Pharmacology and Molecular Docking
NIU Lu-fei ZHANG Yan WANG Ru-yi
（1. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China;
2. The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China）
【Abstract】Objective：
To study the effective components，targets and pathways of Bushenhuoxue Compound in the treatment of angina pectoris by means of network pharmacology and molecular docking test. Methods：
Firstly，the pharmaceutical components and targets of Bushenhuoxui Compound were searched by using TCM system of Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），and the drug targets were filtered and screened by using UniProt database. Secondly，the disease targets of angina pectoris were obtained through GeneCards database，pharmGKB database，TTD database and Drugbank database. Finally，the drug target of Bushenhuoxue Compound was intersected with the disease target of angina pectoris，so as to obtain the effect targets of Bushenhuoxue Compound in treating coronary heart disease. Cytoscape3.9.0 software was used to construct the network diagram of drug components and target. The protein interaction network（PPI）was drawn on the String website and the PPI network core was screened by using Cytoscape3.9.0 software and R software. The effect targets were performed by GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis. After that，the molecular docking verification was completed by AutoDock software，and the visual molecular docking diagram was drawn in Pymol software. Results：
109 blood components of Bushenhuoxuei Compound for the treatment of angina pectoris were obtained，among which quercetin，luteolin，kaempferol and baicalin were the key components. There were 149 drug-disease intersection targets. The GO enrichment results of intersection targets showed that biological processes（BP）mainly involved the main items including the response to oxygen level，lipopolysaccharide response，response to nutrient level，response to oxidative stress，response to bacterial-derived molecules，etc. 99 cell components（CC）were obtained，and the main items included membrane valve，membrane microregion，vesicular cavity，plasma membrane lateral，secretion granule lumen，etc. 195 items of molecular function（MF）were obtained，including the combination of DNA transcription binding factor，the combination of RNA polymerase II specific DNA binding transcription factor，nuclear receptor activity，ligand-activated transcription factor activity and catecholamine binding，etc. KEGG analysis was mainly concentrated in lipid and atherosclerotic pathways. Molecular docking experiments showed that the key active components and core targets could form stable spatial structures by hydrogen bonding. Conclusion：
The results of network pharmacology and molecular docking indicate that the mechanism of Bushenhuoxue Compound in the treatment of angina pectoris lies in the application of active ingredients of quercetin，luteolin，kaempferol and baicalin，with AKT1 and MKPT1 as the key targets to exert therapeutic effects through lipid，atherosclerotic pathway and aging signaling pathway in diabetic complications. The study provides the basis and reference for exploring the mechanism of Bushenhuoxuene Compound in treating angina pectoris.
【Key words】Bushenhuoxue Compound; Angina Pectoris; Network Pharmacology; Molecular Docking
冠心病心绞痛是动脉粥样硬化或血管内壁斑块的形成导致管腔狭窄或血液流变学改变，从而发生冠状动脉循环障碍，进而影响心肌细胞的血液供应［1］。冠心病心绞痛的主要临床症状是发作期胸部不适或后胸骨阵发性压痛等影响患者的生活质量，严重者可出现心肌梗塞甚至危及患者生命。冠心病心绞痛在中国已是导致患者死亡的主要原因之一［2］。我国心绞痛发病率为3.6%，50岁以上发病率为8%，且发病率呈逐年增长趋势，严重威胁人类健康［3］。冠心病心绞痛的主要病理基础是动脉粥样硬化（AS）［4］。并且中医隶属于“胸痹”“真心痛”范畴，一般由心脉痹阻而诱发疼痛［5］，故在治疗时应以活血化瘀，抗炎止痛为主。补肾活血复方，是吾师张艳教授临床从医30多年的经验总结的，主要由黄精、菟丝子、丹参、黄芪、人参、红花、益母草、三七八味药构成。黄精具有抗炎，保护心肌细胞、抗动脉粥样硬化的而作用；
菟丝子可补肾中精血使肾气带动全身气血运行，丹参活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈。黄芪可以改善心肌能量代谢，抑制心肌组织重构，保护心肌［6］。人参具有补元气，通气血，并且可以起到抗动脉粥样硬化的作用［7］。红花可以扩张血管、改善微循环，降压、抗心律失常等作用［8］。益母草抑制心肌缺血性损伤，并且具有抗炎阵痛的作用［9］。三七具有保护心肌细胞，抗心肌缺血等作用［10］。诸药组合可以对改善心肌缺血，抗炎症反应，活血通脉的作用。本研究团队经实验证明补肾活血复方在临床上治疗冠心病心绞痛的患者疗效显著。本文旨在通过网络药理学来寻找补肾活血复方的活性成分和作用靶点，并采用分子对接技术进行验证，来探讨补肾活血复方治疗心绞痛的作用机制，以拓展其疗效范围为，为临床治疗提供更多可能性。
1資料与方法
1.1补肾活血药物成分和药物靶点的获取与筛选通过TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php，2021-12-02）数据库，查找补肾活血复方的有效成分及靶点，按照化合物口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为中药有效成分滤过条件［13］。利用perl软件整合补肾活血复方的有效成分及靶点。在UniProt数据库的UniProtKB功能（https：//www.uniprot.org/uniprot/，2021-12-02）中筛选“Human”“Reviewed”基因库并下载，利用perl软件来过滤补肾活血复方的潜在靶点。
1.2药物作用疾病靶点的获取以“angina pectoris”为关键词在GeneCards（https：//www.genecards.org/，2021-12-03）数据库；
TTD（https：//www.omim.org/，2021-12-03）数据库；
pharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/，2021-12-03）数据库获取心绞痛的疾病靶点，去重合并各数据库疾病靶点并应用R软件安装Venn包来绘制Venn图。之后利用R软件筛选金银花-连翘与病毒性心肌炎共同靶点，并绘制Venn图。
1.3构建“药物成分—作用靶点”网络关系图将上述得到的药物活性化成分和作用靶点导入到Cytoscape3.9.0软件中，使用Cytoscape3.9.0软件构建“药物成分—作用靶点”网络关系图。
1.4绘制蛋白互作网络（PPI）并筛选PPI网络核心将药物作用疾病的作用靶点在String（https：//cn.string-db.org/，2021-12-04）网站中，限制物种为“Homo Sapiens”绘制蛋白互作网络。利用Cytoscape3.9.0软件中的CytoNCA插件对PPI网络进行拓扑分析，并联合R软件找出每个条件大于中位值的基因。重复筛选，最终获得该网络的核心靶点，即为药物作用的关键靶点。
1.5GO富集分析和KEGG富集分析在R软件中安装BiocManager软件包，然后安装org.Hs.eg.db包，利用“org.Hs.eg.db”将药物作用疾病的作用靶点转换为entrezID。利用R软件的BiocManager软件包安装colorspace包、stringi包、ggplot2包、DOSE包、clusterProfiler包、enrichplot包，通过转换得到的entrezID，以Q<0.05，P<0.05进行基因本体论（GO）富集分析并绘制柱状图。利用R软件安装pathview包，通过转换得到的entrezID，以Q<0.05，P<0.05进行基因组百科全书（KEGG）富集分析并绘制柱状图及获取关键通路的通路图。
1.6分子对接把补肾活血复方治疗心绞痛的4个关键活性成分：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、汉黄芩素（wogonin），通过PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/，2022-4-5）数据库下载以上4个活性成分的分子结构，并使用Chem3D软件进行能量最小化处理，保存为mol2格式。在14个PPI网络关键靶点中，根据度值（degree）的高低取前5个关键靶点进行分子对接。使用UniProt（https：//www.uniprot.org/，2021-12-05）数据库对5个关键靶点检索，筛选条件为“Human”“Reviewed”。并在PDB（https：//www.rcsb.org/，2022-4-05）数据库下载关键靶蛋白的PDB格式文件，依次为AKT1、MKPT1、MYK、STATI、TP53利用AutoDock软件进行分子对接，使用 Pymol 软件绘制可视化分子对接图，并根据连接性能进行评分，从而推测药物活性成分与靶点蛋白的结合方式。
2结果
2.1补肾活血复方药物成分和药物靶点的获取与筛选药物有效成分经OB≥30%和DL≥0.18条件筛选后，从TCMSP数据库中查找到益母草靶点784个，有效成分8个；
菟丝子靶点489个，有效成分11个；
三七靶点715个，有效成分8；
人参靶点748个，有效成分22个；
黄芪靶点953个，有效成分19个；
黄精靶点515个，有效成分11个；
红花靶点1446个，有效成分22个；
丹参靶点2566个，有效成分65个。利用perl软件整合补肾活血复方的有效成分及靶点后，将补肾活血复方的活性成分对应的靶点与Uniprot基因库相匹配，共过滤出2709个药物靶点。
2.2药物作用疾病靶点的获取以“atrial fibrillation”为关键词在GeneCards数据库、pharmGKB数据库、TTD数据库、Drugbank数据库进行疾病靶点检索。其中Genecar数据库检索结果以Relevance score>1进行过滤。将4个数据库检索结果整合去重后共获得疾病靶点1776个，各数据库获取疾病靶点情况绘制Venn图（见图1）。通过R软件筛选到补肾活血复方治疗心绞痛的共同靶点149个，并绘制Venn图（见图2）。
2.3“药物成分—作用靶点”网络构建与分析将补肾活血复方的药物活性化成分和作用靶点导入Cytoscape3.9.0软件中，来绘制“药物成分—作用靶点”网络关系图（见图3）。该网络中共有259个节点，844条边，109个入血成分和150个靶点。根据入血成分的度值（degree）由高到低进行排序，选取前4个，依次为槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、黄芩素（baicalein）作为补肾益脑丸治疗心绞痛的关键入血成分。
2.4绘制蛋白互作网络（PPI）并筛选PPI网络核心在string网站绘制蛋白互作网络关系图（见图3）。经两次Cytoscape3.9.0软件的CytoNCA插件拓扑分析联合R软件的重复筛选后，最终获得14个核心靶点（见图5）。包括STAT1、FOS、MYC、CTNNB1、EGFR、TP53、HIF1A、HSP90AA1、MAK1、ESR1、MAPK14、AKT1、STAT3等，即为补肾活血复方治疗心绞痛的关键靶点。
2.4.1GO富集分析将149条信号通路经R软件运行后GO富集分析选取生物学过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）三部分，共确定与心绞痛发生发展过程密切相关的条目2732个。每个部分选取富集最显著的10个绘制GO富集条形图（见图6）。分别得到生物过程（BP）2438条，主要条目包括对氧气水平的反应（response to oxygen levels）、脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对营养水平的反应（response to nutrient levels）、对氧化应激的反应（response to oxidative stress）、对细菌来源分子的反应（response to molecule of bacterial origin）、對缺氧的反应（response to hypoxia）、对金属离子的反应（response to metal ion）、对氧气水平降低的反应（response to decreased oxygen levels）、对外源性刺激的反应（response to xenobiotic stimulus）等。得到细胞组分（CC）99条，主要条目包括薄膜阀（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）、水泡腔（vesicle lumen）、质膜外侧（external side of plasma membrane）、分泌颗粒管腔（secretory granule lumen）等。得到分子功能（MF）195条，主要条目包括DNA转录结合因子结合（DNA-binding transcription factor binding）、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合（RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding）、核受体活性（nuclear receptor activity）、配体激活的转录因子活性（ligand-activated transcription factor activity）、儿茶酚胺结合（catecholamine binding）等。
2.4.2KEGG富集分析将149条信号通路经R语言运行后共富集到170条KEGG通路，选取富集最显著的前30个绘制条形图（见图7）。KEGG富集结果显示，补肾活血复方治疗心绞痛可能的作用通路主要富集在脂质与动脉粥样硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、流体剪切力与动脉粥样硬化通路（Fluid shear stress and atherosclerosis）、糖尿病并发症中的衰老信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、（Prostate cancer）、（Proteoglycans in cancer）等信号通路。
2.5分子对接结果使用SYBYL-X 2.0软件分别处理关键靶蛋白的PDB文件，删除水分子、添加氢键、提取配体分子并创建活性口袋，从而获得核心蛋白的可靠对接模型。将quercetin、luteolin、kaempferol、baicalein四个关键入血活性成分分别和核心靶点AKT1（PDB ID：3OS5）、MKPT1（PDB ID：4BJX）、MYK（PDB ID：1NME）、STATI（PDB ID：6R3S）、TP53（PDB ID：5HMI）进行分子对接，并导出对活性成分—核心靶点连接性能（表1），在R软件中安装pacman软件包，运行Perl脚本得到活性成分—核心靶点的连接性能热图（图9）。选取与核心靶点连接性能Total_Score评分较高的活性成分，分别为AKT1（PDB ID：3OS5）—baicalein、MKPT1（PDB ID：4BJX）—quercetin、MYC（PDB ID：INME）—quercetin、STATI（PDB ID：6R3S）—luteolin、TP53（PDB ID：5HMI）—kaempferol构成对接图（见图9）。对接结果显示：关键活性成分与核心靶点能够通过氢键进行结合，可以形成稳定的空间结构。
3讨论
心绞痛是中国的一项重大的公共卫生挑战，随着我国人口老龄化的加剧，心绞痛的患病率一直在上升，中医药临床实践历史悠久，许多重要在治疗心绞痛的方面发挥的重要的作用，且治疗效果良好［11］。吾师经过多年临床经验得出补肾活血复方。补肾活血复方中黄精、桂枝为君，黄精可补肾中精气，同时又健脾利肺［12］。桂枝温经通络、温阳利水，黄精、桂枝同为君药，主理心肾二脏之精血，黄精补助肾精化生心血，使心血充盈有来源，益肾气以增强射血功能。桂枝发挥疏通脉道的作用，通经活络，使得心脉恢复正常生理功能［13］。黄芪、人参为臣，补气为上乘，温补脾肺之气，助心气行血，缓解心悸、胸闷胸痛等症状。红花、益母草、三七、丹参同属活血化瘀药均可起到活血化瘀的作用，以此达到治疗心绞痛的作用。
本研究使用TCMSP数据库和Ctyoscape3.9.0构建了药物靶成分相互作用网络，根据入血成分的度值（degree）得到槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、黄芩素（baicalein）等关键入血成分，以及涉及到了补肾活血复方的109个活性成分。槲皮素、木犀草素、山奈酚是黄酮类化合物，黄酮类化合物已被证明对心血管疾病有效［14］。槲皮素槲皮素除了抗氧化、抗炎外，还可改善冠心病患者心脏的舒张功能，减少心绞痛时间与发作次数，能起到保护缺血心肌、抑制动脉粥样硬化的形成进而达到防治冠心病和心绞痛的作用。山柰酚是天然的螯合剂，可螯合体内的亚铁和亚铜离子来减少羟自由基形成，发挥抗氧化作用。已有的研究显示，木犀草素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及保护心血管、治疗动脉硬化症、糖尿病以及肥胖症等作用［15］。黄芩素明显降低 MDA 含量，减轻氧化应激。SOD 是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，能调节血脂，预防动脉粥样硬化以及高血脂引起的心脑血管疾病。吴泽成等研究表明黄芩素可提高机体抗氧化酶 SOD 的活性，增强对 ROS 的清除，发挥其强大的抗氧化能力，发挥对机体的保护作用。
PPI蛋白互作网络作用图显示，补肾活血复方治疗心绞痛的核心靶点包括STAT1、FOS、MYC、CTNNB1、EGFR、TP53、HIF1A、HSP90AA1、MAK1、ESR1、MAPK14、AKT1、STAT3等。GO富集分析過程表明补肾活血复方有效成分可能与氧化应激，对脂多糖，活性氧化代谢有关，说明补肾活血复方的有效成分可能通过以上的生物过程在心绞痛的治疗中发挥作用。KEGG分析得170条通路。显示表明，动脉粥样硬化是治疗心绞痛的重要途径。由于动脉粥样硬化是一种严重的心血管疾病，由于动脉粥样硬化会使心脏官腔狭窄，导致心脏血流减少，导致心绞痛的发生。
本研究将活性成分与核心靶点进行分子对接，分子对接表明关键活性成分与核心靶点能够形成稳定的空间结构。并且总分在8.6分以上，提示MKPT1与luteolin、baicalein的结合力最强，为探索补肾活血复方抗心绞痛的综合机制提供依据。
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（收稿日期：2022-08-22）
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