袁雪侦，彭玉婷，涂美艳，梁 东，徐子鸿，，王玲利，夏 惠*
（1.四川农业大学园艺学院，成都 611130；
2.四川省农业科学院园艺研究所，成都 610011）
猕猴桃为猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia）雌雄异株的藤本果树，其根为肉质根，对缺氧极其敏感。降雨量大或短时强降雨都会导致果园发生涝害[1]，使植株根系处于缺氧环境，进而影响自身生理代谢，严重抑制了果树的生长发育[2]。在猕猴桃生产过程中，淹水胁迫成为其生长发育的限制因子。我国是世界猕猴桃栽培第一大国，提高猕猴桃的抗涝性对维持猕猴桃正常生长发育，稳定产量，扩大产区规模具有重要的意义[3]。
褪黑素（MT）是一种广泛存在于生物体内的吲哚类激素，在植物中具有多种功能，不仅参与植物生物钟节律性调控[4]，作为一种内源激素还调控植物的生长发育，同时也参与到植物生物和非生物胁迫的应答与防御反应[5]。在不同的植物中，MT已被证明具有提高植物对高温[6]、低温[7]、干旱[8]和盐胁迫[9]的抵抗能力。陈东等[10]研究发现MT浸种处理降低了淹水胁迫下水稻幼苗的丙二醛（MDA）含量，提高了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性，其中以100µmol/L MT效果最好；
高帆等[11]研究发现盐胁迫导致美味猕猴桃实生苗的脯氨酸、MDA、SOD、POD和CAT活性先上升再下降，抗坏血酸和可溶性蛋白含量先减少再增加，过氧化氢（H2O2）和可溶性糖含量显著上升，而根灌0.1µmol/L MT预处理显著缓解了幼苗所受的损害；
夏惠等[12]研究发现100～200µmol/L MT预处理显著降低了叶片相对电导率和MDA含量，提高了脯氨酸、SOD、POD和CAT活性，有效缓解了高温胁迫对猕猴桃幼苗的损害；
Wang P.等[13]通过对干旱胁迫下的苹果树喷施100µmol/L MT溶液，发现MT有效降低了叶片H2O2含量，并显著提高了抗氧化酶活性等。但截至目前关于应用褪黑素增强猕猴桃耐涝性的研究鲜有报道[14]。
本试验以‘布鲁诺’和‘红实2号’当年生实生苗为材料，通过不同浓度外源MT预处理后进行淹水胁迫，测定相关生理指标，结合隶属函数法综合评价出最适外源MT预处理浓度，以期为MT在提高果树抗涝性中的应用提供参考。
1.1 试验材料与处理
供试材料为当年生美味猕猴桃品种‘布鲁诺’（A.deliciosa cv.Bruno）和中华猕猴桃品种‘红实2号’（A.chinensis cv.Hongshi.2）的实生苗。收集的种子低温沙藏1个月后，在装满基质（草炭∶珍珠岩=2∶1）的育苗盘（42 cm×42 cm×5 cm）播种，在四川省农业科学院园艺研究所温室大棚进行育苗。当幼苗长至三叶一心时，选取长势一致的壮苗移栽于营养钵（10×10 cm）中，每钵一株。利用喷灌设备进行正常水分管理，并在幼苗完全展开子叶后，每两周浇一次0.2%的尿素和0.2%磷酸二氢钾。
当幼苗长至8叶期时，进行试验处理。选择整齐一致的壮苗300钵，平均分成5组处理：CK，正常浇水管理；
MT0，淹水处理；
MT50，50 µmol/L MT预处理后进行淹水处理；
MT100，100µmol/L MT预处理后进行淹水处理；
MT200，200µmol/L MT预处理后进行淹水处理。MT50、MT100和MT200这3组于19:30左右进行根灌MT处理，每2 d浇灌1次，每次100 mL/钵，CK和MT0组浇灌等量清水，浇灌4次后，除CK组，其余4组进行人工模拟淹水处理，水面高出盆土2～3 cm，每天下午补水。在淹水处理后0、2、4、6和8 d测定叶片气体交换参数后，采取不同处理下的叶片和根系，每个处理每次取4株为一个重复，重复3次。取部分材料用于鲜样指标的测定，如生长参数、叶绿素、气体交换参数、类胡萝卜素、可溶性糖、可溶性蛋白、相对电导率、丙二醛和根系活力的测定，剩余材料置于-80℃超低温冰箱中保存，用于其它指标的测定。
1.2 生长指标的测定
每处理随机取10株，洗净晾干，用米尺测定株高、根长，游标卡尺测定从下往上3～4位叶之间的茎粗，再利用CI-202便携式叶面积仪测定叶面积，最后将植株根、茎、叶剪成适当大小分装，放入烘箱中，在105℃杀青15 min后，调至80℃烘至恒重，分别用电子天平称取干重，计算平均值。
1.3 生理指标的测定
叶绿素、类胡萝卜素、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA含量、SOD和POD活性的测定参照李合生的方法[15]；
相对电导率的测定参照徐新娟[16]的方法；
过氧化氢（H2O2）含量和CAT活性的测定采用紫外分光光度法[17]；
根系活力的测定参照高俊凤的方法[18]；
根系苹果酸脱氢酶（MDH）活性和乙醇脱氢酶（ADH）活性的测定参考郭欣欣的方法[19]。
1.4 隶属函数法
首先计算出各处理组抗涝相关指标的具体隶属值，当指标与耐涝性呈正相关时，利用公式（1）进行计算，呈负相关时，利用公式（2）进行计算：
式中：U（Xi）为每个指标的耐涝隶属函数，Xi为第i个指标的测定值，Xmin、Xmax为第i个指标的最小测量值和最大测量值。
1.5 数据统计与分析
利用Microsoft Excel 2020进行数据分析及图表制作，用SPSS 22.0进行显著性分析。
2.1 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗外观形态的影响
与正常浇水对照（CK）相比，淹水处理第8天，两个品种的幼苗叶片均出现不同程度的卷曲、萎蔫，根系损伤明显。但褪黑素预处理组幼苗叶片和根系状态好于MT0组，其中MT50组状态与CK最接近，缓解效果最明显（图1）。
图1 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗表型的影响Figure 1 Effects of melatonin on and morphology in kiwifruit seedlings under waterlogging stress
2.2 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗生长指标的影响
淹水处理第8天，两个品种的株高、根长、茎粗、叶面积和干重整体表现为：CK>MT50>MT100>MT200>MT0。与CK相比，两个品种MT0的株高、根长、叶面积和叶干重均显著性降低，‘布鲁诺’的根干重和‘红实2号’的茎干重也显著性减少,而MT预处理不同程度地提高了株高和叶面积（表1）。
表1 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗生长指标的影响Table 1 Effects of melatonin on growth indexes in kiwifruit seedlings under waterlogging stress
2.3 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗光合色素的影响
淹水处理第8天，两个品种的叶绿素、类胡萝卜素含量提高，表现为：MT100>MT50、MT200>MT0>CK，而叶绿素a/b减小，但MT50～MT200整体大于MT0（表2）。
表2 褪黑素对淹水胁迫下光合色素的影响Table 2 Effects of melatonin on photosynthetic pigments under waterlogging stress
2.4 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗气体交换参数的影响
淹水第0天，两个品种不同处理组的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）和胞间CO2浓度（Ci）均无明显差异。淹水处理后，气体交换参数Pn、Gs和Tr均较对照显著下降，MT处理有一定的缓解作用，其中MT100处理的Pn下降程度最低。对于Ci，淹水处理前期（2～4 d）变化不明显，但在后期（6～8 d）显著高于对照，其中MT100处理增幅最大（图2）。结果表明，淹水胁迫导致猕猴桃幼苗气体交换参数的下降，但外源MT能减缓淹水胁迫对光合参数的影响，以100µmol/L MT对两个品种的效果最明显。
2.5 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗渗透调节物质的影响
淹水第0天，两个品种不同处理组的可溶性糖和可溶性蛋白含量均无显著性差异（图3）。
图3 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗可溶性糖、可溶性蛋白含量的影响Figure 3 Effects of melatonin on soluble sugar and soluble protein in kiwifruit seedlings under waterlogging stress
淹水第2～8天，‘布鲁诺’CK对照组的可溶性糖含量均小于MT处理组，差异显著。MT处理组中，淹水第4天，MT100的可溶性糖含量最高，MT0最低，MT100的可溶性蛋白含量最高，MT0、MT50和MT200差异不显著。淹水第8天，MT100的可溶性蛋白含量最高，差异显著。
淹水第2～8天，‘红实2号’CK对照组的可溶性糖含量均小于MT处理组。MT处理组中，淹水第2天，MT50的可溶性糖含量最高，淹水第6、8天，均表现为MT100>MT50>MT200>MT0。淹水第8天，MT100的可溶性蛋白含量最高，差异显著。
综上可知，淹水胁迫导致猕猴桃幼苗渗透调节物质的上升，总体表现为：MT50、MT100>MT200>MT0。结果表明，外源MT能促进渗透调节物质的合成，进而增加细胞渗透势，提高抗涝性，其中‘布鲁诺’在100µmol/L MT处理下效果最好，‘红实2号’以50、100µmol/L MT较好。
2.6 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗细胞膜透性的影响
淹水第0天，两个品种不同处理组的相对电导率、过氧化氢（H2O2）和丙二醛（MDA）含量差异不明显，淹水第2～8天，CK对照组整体上小于MT处理组（图4）。
图4 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗相对电导率、H2O2、MDA含量的影响Figure 4 Effects of melatonin on relative conductivity,H2O2,MDA in kiwifruit seedlings under waterlogging stress
MT处理组中，淹水第8天，‘布鲁诺’MT50的相对电导率最低，其余MT处理差异不显著；
淹水第4天，MT50的MDA含量最低，MT0最高，差异显著，淹水第8天，MT100最低；
淹水第6天的MT100和淹水第8天的MT50处理组的H2O2含量最低，差异显著，MT0最高。
MT处理组中，淹水第4天，‘红实2号’MT100的相对电导率最低，淹水第8天，MT50最低，MT0最高；
淹水第2～8天，MT50～MT200的MDA含量较MT0下降，其中MT50的下降幅度最大；
淹水第8天，MT0的H2O2含量最高。
综上可知，淹水胁迫导致猕猴桃幼苗细胞膜透性增大，但MT50～MT200的相对电导率、H2O2和MDA含量总体上小于MT0，总体表现为MT50、MT100 淹水第0天，两个品种不同处理组的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性差异均不显著，淹水第2～6天时，CK对照组小于MT处理组，淹水第8天，整体上高于MT0（图5）。 图5 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗SOD、POD、CAT活性的影响Figure 5 Effects of melatonin on activities of SOD,POD and CAT in kiwifruit seedlings under waterlogging stress MT处理组中，淹水第8天，‘布鲁诺’MT100的SOD活性最高； MT处理组中，淹水第2天，‘红实2号’MT50的SOD活性最高，淹水第8天，MT100最高，MT0最低，差异显著； 综上可知，淹水胁迫下，两个品种MT50～MT200的抗氧化酶活性总体上大于MT0，总体表现为MT50、MT100>MT200>MT0，结果表明，外源MT增强了植物清除活性氧、稳定质膜透性的能力，以50、100µmol/L MT对两个品种的效果更明显。 淹水第0天，两个品种不同处理组的根系活力、苹果酸脱氢酶（MDH）和乙醇脱氢酶（ADH）活性差异均不明显，淹水第2～8天，根系活力和MDH的CK对照组大于MT处理组（图6）。 图6 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗根系活力、MDH、ADH活性的影响Figure 6 Effects of melatonin on root activity,MDH,ADH in kiwifruit seedlings under waterlogging stress MT处理组中，淹水第6天，‘布鲁诺’MT100的根系活力最高，MT0最低，而MT50的ADH活性最高，MT0最低，差异显著。淹水第4天，MT50～MT20 0的MDH活性大于MT0。 MT处理组中，淹水第4天，‘红实2号’MT100的根系活力最高，MT0最低，差异显著，淹水第8天，MT50最高。淹水第2～8天，MT50～200的MDH活性大于MT0。淹水第4天，MT100的ADH活性最高，MT0最低，淹水第8天，MT100最高，其余MT处理差异不显著。 综上可知，淹水胁迫导致根系活力和MDH活性下降，两个品种MT50～MT200的根系活力和MDH、ADH活性总体上大于MT0，总体表现为MT50、MT100>MT200>MT0。结果表明，外源MT能减缓淹水胁迫对植物根系结构和功能的影响，以50、100µmol/L效果更明显。 本试验中，通过对各项指标测定值进行定量转换，计算株高、根长、茎粗等27项指标的隶属函数值，再计算出平均值作为淹水胁迫下两个品种生长状况的综合评定结果，函数值越大代表猕猴桃幼苗所处的环境越适宜。由表3可知，两个品种的隶属函数均值排序为CK>MT100>MT50>MT200>MT0，MT50～MT200的函数值均介于CK与MT0之间，说明不同浓度外源MT预处理对淹水胁迫下两个品种幼苗的生长具有缓解作用，且以100µmol/L MT的抗涝效果最好。 表3 隶属函数综合评价Table 3 Membership function comprehensive evaluation 当遭受淹水胁迫时，植物会通过主动或被动的形态调节来提高适应性[20]。根系是生理活性物质同化和转化的重要场所，其生长状况和新陈代谢直接影响地上部的发育、干物质的累积和最终产量的形成[21]。本试验中，淹水胁迫导致猕猴桃幼苗卷曲萎蔫，抑制了株高、根长、茎粗、叶面积和干重等形态指标。外源MT根灌预处理促进了淹水胁迫下猕猴桃幼苗生长参数的增加，减小了幼苗受害程度，这与刁倩楠[22]和高青海[23]的研究结果一致，其中，50µmol/L MT处理组的幼苗状态和各生长参数与CK对照组最接近，比100、200µmol/L MT效果更好，表明MT处理能有效缓解淹水胁迫对猕猴桃生长发育的抑制，促进猕猴桃生长及内部营养物质的积累[24]。 光合色素是植物进行光能的吸收、传递和转化的重要物质基础[25]。MT有助于保护叶绿素分子的完整性从而维持较高的光合效率[26]。本试验中，淹水胁迫第8天，叶绿素和类胡萝卜素含量的升高是一种适应行为，尹冬梅[25]和罗芳丽[27]等也有相同的报道。何斌源等[28]认为叶绿素含量增加是红树对淹水胁迫的适应机制之一，随着水淹时间的延长，相当于处于较荫蔽的环境，光合色素含量的增加有助于集中在较短的光照时间内采光。本研究结果表明猕猴桃可能也存在类似的机制。淹水胁迫会导致植物叶片气孔关闭，以减少水分的蒸发，但同时会影响气体扩散，降低光合作用，还会造成活性氧增加，对光合反应中心和叶绿体结构产生一定破坏[29]。本试验中，两个品种 MT0～MT200的Pn、Gs和Tr均低于CK，Ci在第2、4天低于CK，在第6、8天时高于CK，说明淹水前期光合效率下降主要是由气孔限制导致的，淹水后期主要由非气孔限制引起的，是光合器官受到损伤[30]。MT根灌预处理改善了淹水胁迫下猕猴桃幼苗的光合作用，其中，50、100µmol/L MT的处理效果明显高于200µmol/L，与杨小龙[31]关于MT对干旱胁迫下番茄光合作用的研究结果一致。说明低中浓度MT能更好地促进叶片光合色素含量的增加，保护叶绿体和光合作用机构，进而提高光合作用[32]。 细胞膜具有控制细胞与外界环境物质交换和信息传递的作用，能维持细胞的微环境，稳定细胞的代谢过程[33]。正常情况下，植物细胞内自由基的产生与消除处于动态平衡，当遭受胁迫时，会产生大量活性氧，造成膜相变和膜结构的破坏[11]。本试验中，淹水胁迫下两个品种MT0～MT200的相对电导率、H2O2和MDA含量大于CK，表明淹水胁迫导致幼苗产生大量H2O2，造成氧化损伤，进而使细胞受损，膜透性增大，细胞内电解质外渗，细胞物质交换平衡被破坏，膜脂过氧化产物MDA增加，但两个品种MT50～MT200均低于MT0，表明不同浓度MT预处理减缓了相对电导率、H2O2和MDA含量的增加，其中，以50、100µmol/L MT效果比200µmol/L更明显，说明低、中浓度MT对活性氧的清除具有更高的效率，能保护细胞膜的完整性，进而降低活性氧对细胞膜的伤害。在胁迫过程中，植株会通过提高渗透调节物质及抗氧化酶活性来缓解胁迫造成的损伤。SOD、POD和CAT是植物体内重要的细胞保护酶，主要作用是清除活性氧自由基，使活性氧保持动态平衡，进而保持细胞膜的稳定性[34]。本试验中，淹水胁迫下两个品种MT50～MT200的SOD、POD和CAT活性整体高于MT0，50、100µmol/L MT的处理效果明显高于200µmol/L，表明低、中浓度MT更能提高抗氧化酶的活性、基因表达量，促进了内源抗氧化剂的再生，降低了活性氧水平，从而保护生物膜免受氧化损伤[35-37]。与赵成凤[38]和尉欣荣[39]关于喷施100µmol/L MT对干旱胁迫下玉米和黑麦草的缓解效果一致。 根系主要供应植株生长所需要的水分和矿物质，根系活力是体现植物根系吸收、合成、氧化还原能力和生长发育状况的综合指标[40]。根系呼吸作用能为植物生命活动提供所需要的大部分能量，本试验中，淹水胁迫下两个品种MT0～MT200的根系活力和MDH活性小于CK，ADH活性整体大于CK，表明淹水胁迫导致植物有氧呼吸受阻，ATP供应不足，无氧呼吸被促进，ATP合成减少[41]，其中，MT50～MT200总体高于MT0，50、100 µmol/L MT的处理效果明显高于200µmol/L，表明低、中浓度MT预处理能更好地缓解淹水胁迫对根系的损伤，使植株仍然能维持自身根系的生理机能，从而保证地上部的生长。 单一的指标不能充分反应猕猴桃对涝害的适应能力，也不能筛选出最适MT预处理浓度，只有通过多项指标的综合评价，才能较准确地反映猕猴桃的抗涝性，而隶属函数法是模糊数学的一种方法，是将原本孤立的指标采用统计的方法转化为综合指标，因而评价结果较为准确和可靠。本试验中，隶属函数分析结果表明，两个品种的最佳MT根灌预处理浓度均为100µmol/L。 综上所述，不同浓度褪黑素根灌预处理通过提高猕猴桃幼苗的根系活力、渗透调节能力和光合作用减小了淹水胁迫对猕猴桃幼苗的损害，从而促进了猕猴桃幼苗的生长发育和干物质的积累。综合评价得，两个品种在100µmol/L MT预处理下对淹水胁迫的缓解效果最好。2.7 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗抗氧化酶活性的影响
淹水第4～8天，POD活性均表现为：MT100>MT200>MT50>MT0；
淹水第4～8天，CAT活性均表现为：MT50>MT100>MT200>MT0。
淹水第2～6天，POD活性均表现为：MT100>MT50>MT200>MT0，差异显著；
淹水第8天，MT100的CAT活性最高，MT0最低，差异显著。2.8 褪黑素对淹水胁迫下猕猴桃幼苗根系活力及呼吸酶活性的影响
2.9 隶属函数综合分析
3.1 褪黑素根灌预处理缓解了淹水胁迫对猕猴桃幼苗表型的损伤
3.2 褪黑素根灌预处理促进了淹水胁迫下猕猴桃幼苗的光合作用和抗氧化酶活性
3.3 褪黑素根灌预处理促进了淹水胁迫下猕猴桃幼苗的根系活力和呼吸酶活性
3.4 隶属函数综合分析