由佳，李明举，许海军，郭龙宗，李玉燕，戚卿业
(1.烟台市农业技术推广中心，山东 烟台 264001；
2.烟台市动物疫病预防与控制中心，山东 烟台 264003；
3.山东益生畜牧兽医科学研究院，山东 烟台 265508；
4.诸城外贸有限责任公司，山东 淮坊 262200)
鸡大肠杆菌病(colibacillosis) 是由鸡源致病性大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)引起的细菌性传染病。大肠杆菌的多种毒力因子共同决定着细菌的致病性，在宿主受到大肠杆菌的侵袭进而引发疾病的过程中，这些毒力因子共同作用，互相协调。目前，已知的主要毒力基因有：铁离子获得系统(耶尔森菌毒力岛、气杆菌素)、黏附素、温度敏感血凝素、血清抗性蛋白、肠细胞脱落位点毒力岛、毒素、ColV 和ColBM 质粒等。本试验通过PCR 方法对胶东地区肉鸡大肠杆菌进行毒力基因研究，以掌握肉鸡大肠杆菌毒力基因的分布情况，为深入研究大肠杆菌致病机理、制定有效防控措施提供数据支持。
1.1 材料
1.1.1 病料
胶东地区多家祖代和父母代肉种鸡场、规模化商品肉鸡场疑似感染大肠杆菌的发病鸡心脏、肝脏、脾脏、气囊；
祖代和父母代肉种鸡场的死亡鸡胚、1 日龄雏鸡卵黄囊。从以上病料中分离到169 株大肠杆菌。
1.1.2 培养基和试剂(见表1)
1.1.3 主要仪器设备(见表2)
1.2 方法
1.2.1 引物设计
根据GenBank 上已发表的毒力基因序列，用Primer 5.0 软件设计出大肠杆菌13 种毒力相关基因的13 对特异性引物，如表3 所示，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
1.2.2 模板制备
将大肠杆菌分离株接种于麦康凯培养基，37 ℃下培养18～24 h，挑取数个单菌落，溶于1 mL 灭菌的生理盐水中，摇匀制成细菌悬液，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min 离心5 min，取上清500 μL 至灭菌离心管中，-70 ℃保存备用。
1.2.3 反应体系及程序
PCR 反应体系：2×PCR Master Mix(含有2×Taq DNA 聚合酶、2×PCR Buffer 和2×dNTP)12.5 μL，10 pmol/μL 的上下游引物各0.5 μL，7.5 μL 的ddH2O，4 μL的模板。
PCR 反应程序：95 ℃预变性5 min，进入PCR 循环，94 ℃变性30 s，Tm 退火30 s，72 ℃延伸45 s，共进行30 个循环。最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
2.1 大肠杆菌分离株毒力基因的PCR 结果
用PCR 法对分离得到的169 株大肠杆菌分离株检测13 种毒力基因，共检出12 种毒力基因，仅hlyA毒力基因未检出，部分阳性菌株PCR 产物电泳结果见图1 至图12。colBM、FimC、iucD、iss、FimA、iutA、fyuA、colV、tsh、irp2、iucA和papC12种毒力基因的检出率分别为100%、100%、86.98 %、86.39 %、79.88 %、68.05 %、58.58%、50.89%、46.75%、38.46%、36.09%和11.83%。其中colBM、FimC两个基因的阳性检出率均为100%，papC基因的检出率最低，为11.83%，其余10 种毒力基因的检出率在86.98%～36.09%。见图13 和表4 。
图1 10 株分离株FimA 基因PCR 产物电泳图
图2 10 株分离株colBM 基因PCR 产物电泳图
图3 10 株分离株iutA 基因PCR 产物电泳图
图4 10 株分离株fyuA 基因PCR 产物电泳图
图5 10 株分离株irp2 基因PCR 产物电泳图
图6 10 株分离株iucA 基因PCR 产物电泳图
图7 10 株分离株iss 基因PCR 产物电泳图
图8 10 株分离株FimC 基因PCR 产物电泳图
图9 10 株分离株tsh 基因PCR 产物电泳图
图10 10 株分离株488 基因PCR 产物电泳图
图11 10 株分离株papC 基因PCR 产物电泳图
图12 10 株分离株colV 基因产物电泳图
3.1 大肠杆菌毒力基因的分布
不同动物源性的大肠杆菌的毒力基因数量众多，且分布复杂。本试验参考大量文献资料，最终选择了在鸡源性致病性大肠杆菌中检出率较高并具有研究意义的13 种毒力基因，并对它们进行检测。1992—2011 年，王利勤(2012)[1]对从在陕西、河南、河北等六省相关鸡场鸡群中分离的320 株鸡源性致病性大肠杆菌分离株进行了毒力基因检测，结果发现colBM(100%)检出率最高，hlyA(0.6%)最低，其他毒力基因及其菌株的检出率由高到低为FimC、fyuA、iucD、iutA、colV、FimA、irp2、tsh、iss、iucA和papC，分别为89.4%、77.8%、73.8%、70.3%、66.9%、64.7%、66.6%、61.8%、55.6%、53.1%和20%。郑志明[2]对195 株禽致病性大肠杆菌分离株中的13 种毒力基因进行了检测，发现毒力基因fimC、iucD、iss、tsh、irp2 和fyuA分别为93.8%、71.8%、60.0%、50.8%、45.1%、45.1%的检出率在40%以上，papC和hlyE毒力基因的检出率分别仅为7.2%和4.1%。本试验结果显示，从胶东地区169 株肉鸡源性大肠杆菌分离株中共检出12 种毒力基因，仅hlyA基因未检出，与王利勤的研究中hlyA基因0.6%的检出率和郑志明的研究中hlyE基因4.1%的低检出率略有相似；
colBM基因的检出率为100%，与王利勤的研究结果相同；
在王利勤和郑志明的研究中FimC基因检出率位居前列，本试验对FimC基因的检出率为100%，比王利勤和郑志明的研究结果偏高；
本试验papC基因的低检出率(11.83%) 与王利勤和郑志明的研究结果基本相似；
此外，iucD、FimA和iss分别为86.98%、79.88%、86.39%的检出率略高于王利勤的研究结果，iutA、fyuA、irp2、iucA、tsh和colV分别为68.05 %、58.58%、38.46%、36.09%、46.75%、50.89%的检出率略低于王利勤的检出结果，但与郑志明的研究结果差别不大。
3.2 不同毒力基因的检出情况
本试验共检测大肠杆菌的黏附素、铁离子获得系统(耶尔森菌毒力岛、气杆菌素)、血清抗性蛋白、大肠杆菌素、溶血素等13 种毒力基因，不同毒力基因在分离株中的检出率各不相同。金文杰[3]对216 株禽源性致病性大肠杆菌分离株的研究显示，黏附素FimC基因的检出率为93.5%，papC基因的检出率仅为6.5%，本试验显示，FimC和FimA两个毒力基因的检出率分别为100%、79.88%，远高于papC基因的检出率11.83%。这与金文杰的研究结果基本相同，说明了黏附素I 菌毛的FimC和FimA基因比P 菌毛的papC基因在鸡源性大肠杆菌中的存在更为广泛；
耶尔森强毒力岛(HPI)fyuA和irp2 基因是大肠杆菌的重要毒力基因，可以作为检测耶尔林强毒力岛的标志[4]，金文杰等[5]发现，在我国分离的禽致病性大肠杆菌中，fyuA+irp2 基因的检出率为44.9%，Oh 等[6]报道，在韩国鸡源性大肠杆菌中，fyuA和irp2 基因的检出率分别为32.8%和27.6%。在本试验所用的169 株分离菌中，fyuA+irp2 强毒力岛基因组合的检出率为63.31%，fyuA和irp2 基因的检出率分别为58.58%和38.46%，均比上述研究结果偏高；
ColBM 质粒和ColV 质粒具有相似的毒力基因，推测ColV 质粒的演变产物可能为ColBM 质粒[7]，本试验中携带大肠杆菌毒力相似的两个基因colBM(100%)和colV(50.89%) 的检出率差异较大，这与王利勤的研究结果相似，检出率差异如此之大有待进一步研究；
溶血素hlyA基因在鸡源大肠杆菌中的检出率极低，其是对人类具有较强侵袭力[8]的肠产志贺毒素大肠杆菌中的主要毒力因子，本试验在分离到的肉鸡大肠杆菌菌株中未检出该毒力基因，表明胶东地区肉鸡大肠杆菌分离株存在极低或不存在人畜共患的安全隐患。