马 帅，郑世磊，赵 明，王 媛，张严琦，邴啟政，段笑笑，曹 志
（1.青岛市动物疫病预防控制中心，青岛 266100；
2.青岛易邦生物工程有限公司，青岛 266114；
3.青岛农业大学，青岛 266109）
猪瘟（Classical swine fever, CSF）也称猪霍乱，是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起的猪和野猪的一种高度接触性、高致死性传染病，一年四季均可发生[1]。猪瘟是世界动物卫生组织（Office international des épizooties, OIE）疫病名录中须申报的陆生动物疫病。虽然通过严格的净化措施，美国、加拿大、澳大利亚、新西兰和荷兰等部分养猪国家已宣布消灭了猪瘟，但对于其他大多数养猪国家（如东欧、东亚及东南亚许多国家），猪瘟仍然是对养猪业危害较大的重要传染病[2]。由于全国范围的猪瘟疫苗接种政策，目前我国猪瘟疫情已得到较好的控制，大规模猪瘟疫情较少发生，但部分地区疫情仍呈点状散发或地方性流行，非典型和繁殖障碍型猪瘟增多，成年猪带毒现象严重[3]。尤其是一些中小型养殖场仍然存在病毒污染，控制和净化工作仍然面临不少困难和挑战[4]。为最终控制和净化猪瘟，我国应持续强化生物安全措施，继续对生猪实施猪瘟免疫，利用高效可靠的诊断技术对疑似病例进行确诊并剔除阳性患病猪。本文对我国猪瘟的分子生物学特征及猪瘟疫苗研究进展进行了综述。
1.1 猪瘟病毒的结构与功能CSFV是单股正链RNA病毒，属于黄病毒科、瘟病毒属。CSFV粒子直径为40～60 nm，近似球形，由三种结构脂蛋白囊膜包裹，表面有不规则形状的纤突，其基因组大小为12.3 kb，由中间的开放阅读框（opening reading frame, ORF）及两侧的5"和3"非翻译区（Untranslated Regions, UTR）构成，其ORF能够编码3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白前体；
多聚蛋白在宿主细胞和病毒自身特异性蛋白酶作用下裂解成12个成熟的蛋白，包括4种结构蛋白（C、Erns、E1、E2）和8种非结构蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[3]。在编码的结构蛋白中，C蛋白为衣壳蛋白，具有保护和转录调节作用，并包含Erns的信号序列和信号肽识别位点[5]。Erns和E2蛋白均为囊膜糖蛋白，两者集中了CSFV的大部分抗原表位，其中E2蛋白保守性最低，是CSFV的主要保护抗原[6]。在非结构蛋白中，Npro蛋白是CSFV ORF编码的第一个蛋白质，具有水解酶活性，其对于病毒的复制并非必不可少，但在CSFV的免疫逃避中发挥重要作用[7]。p7蛋白作为离子通道蛋白参与病毒的毒力，并且介导巨噬细胞中IL-1β的释放[8]；
其余蛋白均与病毒RNA复制相关，NS2蛋白的功能是调节病毒的复制，NS3、NS4A、NS4B、NS5A可以形成复制复合体，NS5B则具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，它们共同参与CSFV的复制过程[9]。基因组的5"-UTR和3"-UTR与CSFV的复制有关，但5"-UTR没有甲基化帽子结构，3"-UTR也没有Poly（A）结构，因此其与一般真核生物的翻译起始机制不同[10]。CSFV的翻译是通过5"-UTR内核糖体内部进入位点（internal ribosome entry site, IRES）与核糖体40S亚基的结合而启动；
而3"-UTR主要介导CSFV基因组的复制，RNA聚合酶通过结合在3"-UTR上而激发RNA的合成[11]。5"-UTR和3"-UTR都是CSFV基因组复制的主要调控位点，并且在属内高度保守。
1.2 猪瘟病毒的基因分型及全球地理分布通过对猪瘟流行毒株基因群和基因亚群进行划分，研究不同地区流行株间的亲缘关系和遗传进化规律，对掌握病毒流行现状、追溯传播来源和传播路径具有重要科学意义。据文献报道，目前常将5"-UTR、E1、E2、NS2、NS3、NS5B和3"-UTR等基因片段用于CSFV基因分型，其中5"-NTR、E2和NS5B 最为常用[12]。基于5"-UTR中的150 nt碱基序列，E2蛋白中的190 nt碱基序列和NS5B蛋白中的409 nt碱基序列，通过序列比对分析可将CSFV分为3个基因型（1型、2型和3型）和11个亚型（1.1、1.2、1.3、1.4、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3和3.4），2.1亚型又可进一步分为2.1a、2.1b、2.1c和2.1d亚型[13]。全球范围内，所有分离自美洲的CSFV都属于基因1型，其中古巴分离株主要为1.2亚型，而洪都拉斯和危地马拉的分离株主要为1.3亚型，阿根廷、巴西、哥伦比亚和墨西哥的分离株在1.1亚型中产生了四个分辨率较差的簇。另有研究表明，古巴分离株与其他已知的CSFV基因1型分离株之间存在较大差异，并形成一个新的亚型，故将其命名为1.4亚型[3]。表1显示了猪瘟病毒各基因亚型的全球分布。基因2型主要由20世纪80～90年代欧洲的分离毒株组成，能够引起流行性感染且病死率较高，为过去几十年普遍流行的基因型。基因3型包括大多数分布于不同程度的天然隔离区域，如韩国、泰国、日本、和英联邦等地区的毒株。近年来，从遗传系统进化树分析发现，在欧洲和亚洲的CSFV流行正从1型和3型向2型转换[14-16]。
表1 猪瘟病毒基因型的全球分布Table 1 Global distribution of CSFV subgenotypes
1.3 我国猪瘟病毒的分子流行病学分析我国开展CSFV分子流行病学研究工作起步较晚，但在解放军军需大学、兰州兽医研究所等科研单位不懈努力下，我国CSFV遗传发生关系及流行态势日渐清晰。我国CSFV的分群研究大部分是基于E2、E0基因序列。1990年代，涂长春[17]通过对全国191株CSFV流行株的E2基因序列进行了遗传进化分析，发现我国CSFV分为2个基因型，4个基因亚型，即基因2型中的2.1、2.2、2.3亚型和基因1型中的1.1亚型。近期研究表明，自21世纪初以后2.2和2.3亚型的流行优势逐渐减弱。目前2.1亚型为我国流行的亚型，其中2.1b亚亚型已成为流行的优势毒株[18]，2.1c亚亚型主要在我国南方流行[13]。Jiang等[19]对2011-2012年在湖南分离的8个流行毒株进行了序列分析，发现5个分离株与广东、广西分离株一起形成了2.1亚型的一个进化分支，形成该新分支的分离株被称为2.1c亚亚型，而2.1c亚亚型在泰国和老挝也有分布。彭志成等[20]将2011年从广东分离的15个2.1亚型毒株进一步分为2.1b、2.1c和2.1d三种亚亚型，而且2.1c亚亚型和2.1d亚亚型的流行在广东被首次报道[21-22]。
为进一步了解我国CSFV的遗传多样性，对2004-2012年广东和广西分离的39个CSFV分离株进行了序列分析。通过对E2基因片段（190 nt）和E2基因全长（1119 nt）序列分析表明，当前流行的CSFV2.1亚型可进一步分为10个亚亚型（2.1a～2.1j），Peng等[3,20]以前鉴定为2.1d亚亚型的分离株被重新分类为2.1g亚亚型。根据时间和空间分布特征，当前最流行的亚亚型为2.1b，其次为2.1d和2.1g亚亚型，而不流行的亚亚型为2.1a、2.1e和2.1f[23]。
总之，2.1亚型是流行最广泛的，其次是地方性散发的1.1、2.2和2.3亚型。在C株疫苗（1.1亚型）的选择压力下，1.1亚型的流行程度逐渐降低，2.2和2.3亚型呈消亡趋势，剩下的2.1亚型是与疫苗株遗传关系最远的毒株，也是我国目前最流行的CSFV毒株[24]。我国CSFV流行株遗传多样性较强，广泛流行的2型毒株与欧洲流行株有一定的亲缘关系，可能源自相同的病毒祖先。尽管我国尚无CSFV基因3型毒株流行的报道，但有必要保持监测以防止其从中国周边地区如韩国、日本等传入[3]。
1.4 我国CSFV的遗传变异与疫苗保护猪瘟弱毒疫苗的普遍使用改变了原有病毒群落和生态环境，全世界的猪瘟流行特点也随之发生重大变化，以温和型猪瘟为主。我国进行猪瘟疫苗免疫已60多年，猪瘟疫情虽已得到有效控制，但并未彻底根除，近年来呈零星散发趋势，既有高死亡率的急性症状，又有持续发生的温和型猪瘟症状，疫情多样复杂[3]。因此，了解猪瘟流行毒株的遗传变异和流行毒株与猪瘟疫苗株的差异，对我国猪瘟的防治具有重要意义。
E2蛋白是CSFV诱导产生中和抗体的主要抗原，是CSFV抗原表位集中的地方，具有高度的免疫原性，研究E2蛋白的变异对制定猪瘟防控策略具有重大意义。表2显示了猪瘟病毒亚型E2基因之间的同源性百分比[3]。我们注意到2.1亚型与1.1亚型（疫苗株）的同源性最低，这也说明了2.1亚型在我国广泛流行的原因。
表2 CSFV各亚型间E2基因同源性百分比Table 2 Percent nucleotide homology of full-length E2 between CSFV genotypes
综合国内其他研究结果发现，我国CSFV流行毒株的变异呈多样性，以远离疫苗株的变异株为主。为研究现有疫苗能否对此类变异株产生有效保护，Zhou等[3]将C株E2基因同2010年～2015年从中国不同地区分离的流行株E2基因进行了比较，发现它们有79.4%～99.0%的核苷酸同源性和78.0%～97.9%氨基酸同源性。此外，Wang等[25]研究了C株疫苗对中国9个不同基因型及致病性流行株的免疫保护作用，结果表明C株疫苗对1.1、2.1和2.2亚型毒株均能产生有效保护，且接种试验毒株的免疫猪没有排毒现象。这些结果为我国继续使用C株疫苗提供了科学依据，但要最终净化经典猪瘟，这还远远不够。为了应对未来的危机，中国应在继续接种传统疫苗的同时，研发使用新的替代疫苗，并持续强化生物安全，以最终实现猪瘟的净化。
目前防控猪瘟的策略是“非免疫扑杀”和“预防免疫”。新型疫苗应有已商业化疫苗同等效力的同时，兼具能够区分疫苗免疫还是自然野毒感染（differentiate infected from vaccinated animals, DIVA）的效果。除了常规弱毒疫苗以外，当前主流研究方向是基于CSFV保护性抗原E2的重组质粒、表达蛋白或合成肽段的开发。
2.1 商业化猪瘟疫苗
2.1.1 猪瘟弱毒活疫苗 猪瘟弱毒活疫苗（modified live vaccine, MLV）包括中国的C株、日本的GPE（guinea-pig exaltation-negative）株、法国的Thiverval株以及墨西哥PAV-250株，常用于亚洲、南美洲中部等猪瘟流行地区的常规免疫[26]。猪瘟疫苗C株是由高致病力毒株（石门株）致弱而来[27]。C株免疫接种后5 d即可提供完整的免疫保护，并可持续6～18个月[28]；
诱导产生的免疫反应能够抵抗CSFV不同基因型（包括基因1、2、3型）强毒攻击，保护机制使其能刺激保护性抗体产生和活化T细胞反应[29]。
2.1.2 CSFV E2亚单位疫苗 CSFV的主要抗原表位均位于E2基因中。基于CSFV E2或Erns蛋白的亚单位疫苗具有区分野毒感染和疫苗免疫的特点，对猪瘟的净化非常有意义。
虽然国际上利用杆状病毒表达系统研发的CSFV E2蛋白重组亚单位疫苗已经全面评估并商业化（分别是拜耳公司BAYOVAC®CSF标记疫苗和英特威公司Porcilis®Pestiwith标记疫苗），但未见在市场流通，尚缺乏临床数据。
目前为止，天康生物股份有限公司研制的猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗（Rb-03株）已获得新兽药注册证书，是将猪瘟病毒E2基因重组于杆状病毒内，在昆虫细胞上培养表达猪瘟病毒E2蛋白而制成的新型基因工程疫苗。该疫苗是国内首个猪瘟亚单位疫苗（能够区分野毒感染和疫苗免疫），可用于鉴别诊断，能区分猪瘟野毒感染和疫苗免疫动物；
并具有良好的安全性，不存在因突变或与野毒发生重组使其毒力返强的危险。
2.2 其他在研的猪瘟基因工程疫苗基于细胞表达平台构建基因工程亚单位疫苗目前已成为国内生物制品企业研究开发热点，其优势在于构建的携带目标基因的工程细胞可实现灌流或悬浮化培养，大大降低了生产成本。此外，人5型复制缺陷型腺病毒活载体猪瘟病毒疫苗和嵌合猪瘟病毒疫苗均能诱导完全的免疫保护，免疫效果与常规的弱毒疫苗相当，并且由于腺病毒载体的复制缺陷，使其兼具灭活苗的安全性和活苗的效力。其他在研新型的猪瘟基因工程疫苗主要有DNA疫苗、基因缺失疫苗、合成肽疫苗等。合成肽疫苗能够诱导猪瘟特异性中和抗体的产生，但临床应用时其对机体提供不了有效的保护，这可能是不同CSFV基因型之间的抗原表位发生变异。
2.2.1 HEK293T细胞表达CSFV E2蛋白的亚单位疫苗 CSFV亚单位疫苗是由青岛易邦生物工程有限公司合作研发，目前正在进行新兽药证书的申报环节。该疫苗是将猪瘟病毒E2基因分别插入慢病毒表达载体，并利用慢病毒能够感染宿主细胞的特性，将E2基因整合到宿主细胞染色体中进行稳定转录表达，可以让细胞持续分泌表达的E2蛋白。将E2蛋白加佐剂和细胞免疫增强剂制备成疫苗，免疫动物后，能够诱导机体产生充分的体液免疫反应。该疫苗在猪体经二次免疫能完全抵抗强毒攻击（数据尚未公开）。
2.2.2 人5型复制缺陷型腺病毒载体猪瘟疫苗（rAdVE0-E2） rAdV-E0-E2是由云南农业大学和青岛易邦生物工程有限公司联合研发，目前已通过转基因生物安全评价，进入临床试验阶段。该疫苗是将猪瘟病毒E0和E2基因分别插入人5型复制缺陷性腺病毒载体CMV启动子下游中进行表达，充分发挥了腺病毒载体的高效表达外源基因能力。（数据尚未公开）。
2.2.3 人5型复制缺陷型腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗（rAdV-SFV-E2） rAdV-SFV-E2是由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研发，目前已通过转基因生物安全评价，进入临床试验阶段。该疫苗是将甲病毒复制子载体的复制子插入人5型复制缺陷性腺病毒载体中，进而构建了一株表达猪瘟病毒E2蛋白的腺病毒/甲病毒复制子嵌合病毒[30-31]，充分发挥了腺病毒载体高效递送的优势和甲病毒载体复制子载体高效表达外源基因的优势。
2.2.4 DNA疫苗 DNA疫苗均基于主要保护性抗原CSFV E2蛋白进行的质粒构建[32-35]。为了提高其免疫效果，通常配合使用一些细胞因子（IL-2、IL-12，IL-18）或者细胞表面调节分子（CD154、CD40和CD81）等[32-33]。然而，临床数据表明只有多次、高剂量的免疫接种才能获得足够的免疫保护，进而导致免疫成本的增加[33]。因此，DNA疫苗只是停留在实验室阶段的研发。
2.2.5 基因缺失疫苗 基因缺失疫苗是基于CSFV全基因感染性克隆的构建，通过对某一段基因的缺失或替换，在保留免疫原性的条件下使其毒力大大降低，同时具有DIVA特性。CSFV Erns、E2、Npro基因缺失疫苗株能够自主复制，且不产生子代病毒（复制子）。研究证实，此类基因缺失疫苗免疫猪后能够提供安全有效的免疫保护[35-38]。
我国拥有世界上最大规模的养猪业，生猪产量占全球产量一半以上。猪瘟是一种具有高度感染性和致死性的传染病，一旦发生，会造成巨大的经济损失，因此猪瘟的控制和净化问题一直备受世界各国关注[39]。目前世界上有预防性免疫和全面扑杀两种控制猪瘟的策略，我国长期以接种兔化弱毒疫苗作为预防猪瘟的主要手段。但长期的疫苗免疫压力、持续性感染的存在以及与其它病原微生物混合感染的发生，使得CSFV在我国的流行特征和发病特点发生了较大变化，凸显了我国猪瘟防控的复杂性。
自2018年8月3日首例非洲猪瘟（ASF）在沈阳被确诊以来，ASF已相继在我国多个省份发生，造成数百亿直接经济损失[40]。而CSF和ASF的临床症状和病理变化极其相似，会干扰彼此的诊断。根据巴西的防控经验，做好ASF的防控有利于CSF的净化，而做好CSF的免疫和防控有利于ASF的诊断和防控。加之目前针对ASF没有有效的疫苗和治疗措施，在此背景下，更加凸显了生物安全以及CSF控制和净化的重要性。在加大ASF的防控和监测力度的同时，加强CSF和其他重大猪病的免疫，并应用标记疫苗结合监测和阳性猪淘汰等手段逐步实现CSF在规模化猪场的净化是可行的。
目前，我国猪瘟防控面临的主要挑战是防止中小型猪场猪瘟的零星暴发。因大型猪场的猪瘟免疫率及生物安全水平较高，而中小型猪场存在猪瘟免疫率低、免疫程序不规范以及缺乏抗体检测等问题。此外，针对CSFV流行株的变异及毒力改变问题，应该持续开展猪瘟流行毒株分子流行病学的调查，密切关注我国流行毒株的分布及变化，以及时调整猪瘟防控策略。加强CSFV病毒学、分子生物学及其免疫机制等基础性研究，加快研制适应未来需要的新型猪瘟疫苗及检测方法，既能克服抗体监测过程中各种干扰因素又能提供快速安全的免疫保护，最终实现我国猪瘟的控制和净化。
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