肖 红,刘玉玲,刘忠宽,李鹏珍,戎郁萍,*
1 中国农业大学草业科学与技术学院, 北京 100193 2 河北省农林科学院农业资源环境研究所, 石家庄 050051
氮(N)和磷(P)作为主要的营养元素,对调控陆地生态系统植物生产力和土壤微生物功能具有重要作用[1]。氮磷肥添加是提高过度放牧退化草地生产力和牧草品质的主要养分管理措施之一[2]。然而,过量的氮输入会使土壤酸化、增加硝酸盐淋溶损失和温室气体排放等[3]。由土壤氮转化微生物驱动的土壤硝化和反硝化过程与硝酸盐淋溶损失和N2O气体排放紧密相关[4—6],因此,了解草原生态系统参与氮循环的主要土壤微生物功能群对养分添加的响应机理有助于草地养分调控,避免养分过量输入引起的氮损失和温室气体排放[2]。
相对于氮转化功能基因,磷转化功能基因的研究较少。磷酸酶由碱性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)组成,是催化磷酸酯(除了肌醇磷酸酯,例如肌醇六磷酸盐)水解释放出磷酸盐的酶。前人研究表明,ALP来自土壤微生物,而ACP主要由植物合成和分泌[18—19]。phoA、phoX和phoD是原核生物编码ALP基因,这三个同源基因的分布随生态系统不同而变化。phoA、phoD和phoX广泛分布在水生生态系统,而陆地生态系统中phoD基因的分布要高于phoA和phoX[20]。因此,phoD基因可作为土壤有机磷转化的标记基因[21]。Hu等[20]研究发现,长期添加高剂量有机肥(秸秆和牛粪)可显著改变编码碱性磷酸酶基因的细菌群落多样性,phoD群落结构主要受土壤有机碳的调控,而不是土壤磷含量。Chen等[22]研究发现,长期添加磷肥增加了phoD基因的多样性,phoD基因丰度与土壤有效磷含量负相关,而编码碱性磷酸酶基因的细菌群落结构与土壤pH和有效磷含量有关。目前关于phoD基因的研究主要集中在农田生态系统中,且氮肥或氮磷肥同时添加对phoD基因丰度和多样性的影响相对较少,phoD基因对氮、磷添加的响应机理尚不清楚。
本研究对氮、磷添加后呼伦贝尔草甸草原不同生长时期土壤氨氧化(amoA-AOA和amoA-AOB)、反硝化(narG、nirK、nirS和nosZ)和磷转化(phoD)基因丰度进行分析,探究土壤理化性质与氮、磷转化功能基因丰度的关系,明确土壤氮、磷转化功能基因丰度及氮损失对氮、磷添加的响应规律,为定向调控土壤氮、磷转化过程,提高养分利用效率,减少温室气体N2O排放提供科学依据。
1.1 试验地概况
研究地点位于呼伦贝尔市海拉尔区特尼河9队(49°20′—49°26′N,119°55′—120°9′E,海拔628—649 m),是大兴安岭西麓丘陵向内蒙古高原的过渡区。该地区属温带大陆性季风气候,年均温-1.2 ℃,1月最冷月平均气温-25.9 ℃,7月最热月平均气温20.0℃,>10 ℃积温1780—1820℃,无霜期90—115 d,年均降水量354 mm,全年降水的75%集中在6—9月份。2018—2020年总降水量分别为289.0 mm、279.0 mm、357.0 mm。草甸草原以羊草(Leymuschinensis)和贝加尔针茅(Stipabaicalensis)建群,土壤为黑钙土或暗栗钙土,土壤pH为6.50,土层厚30—40 cm,表层土壤(0—10 cm)有机碳含量51.0 g/kg,全氮3.7 g/kg,全磷0.5 g/kg。
1.2 试验设计
2018年5月在试验区选取地势平坦、植被分布均匀的草地进行氮磷添加试验,双因子裂区试验设计,主区为氮添加,副区为磷添加。设5个氮水平(N0:不施N；
N1:1.55 g N m-2a-1；
N2:4.65 g N m-2a-1；
N3:13.95 g N m-2a-1；
N4:27.9 g N m-2a-1),3个磷水平(P0:不施P；
P1:5.24 g P m-2a-1；
P2:10.48 g P m-2a-1),共15个处理,4个区组,总计60个小区。每个小区面积2 m×3 m,主区间距2 m,副区间距1 m。氮的添加量参考前人在内蒙古草地进行的氮添加梯度(0—30 g N m-2a-1)[23],1.55 g N m-2a-1的添加量近似等于2000—2010年中国年平均氮沉降量[21],13.95 g N m-2a-1的添加量可达到内蒙古草地植物生长的氮饱和阈值[24]。磷的添加量也参考前人在内蒙古草地进行的磷添加梯度(0—13.9 g P m-2a-1)[25],本研究磷添加量能解除内蒙古草地植物生长磷限制[25]。氮肥使用硝酸铵(NH4NO3,分析纯),磷肥使用五氧化二磷(P2O5,分析纯)。添加时间为2018—2020年,每年6月6日进行氮磷添加。将肥料溶解在24 L水(相当于4 mm的降水)中,以水溶液的形式用喷壶均匀喷施于试验小区,不施肥的小区喷施等量的水。按照当地打草场的利用方式,每年8月底对处理小区进行刈割处理,留茬高度为8 cm。
1.3 土壤样品采集
2020年5月下旬(施肥前,5月28日)、7月和8月中旬(7月15日,8月20日),用直径5 cm的土钻在每个小区内随机取0—10 cm土样4个,混合成1个土壤样品,过2 mm筛后分成三份,一份用于测定土壤含水量,另一份储存于-80 ℃冰箱用于土壤DNA的提取,剩余的土壤自然风干后测定土壤化学性质。
1.4 土壤理化性质测定
土壤全碳(TC)和全氮(TN)用元素分析仪(Vario MAX CN; Elementar, Hanau, Germany)测定。
土壤全磷(TP)和速效磷(Olsen-P)采用钼锑抗比色法测定[26]。
土壤pH用酸度计(FE20-FiveEasyTM, Mettler Toledo, Germany)测定。
1.5 土壤DNA提取及实时荧光定量聚合酶链式反应分析(qRT-PCR)
土壤DNA提取采用土壤基因组DNA提取试剂盒(DP336,天根,中国)。采用罗氏LightCycle 96的实时定量聚合酶链式反(PCR)仪对16SrRNA、phoD、amoA-AOB、amoA-AOA、narG、nirK、nirS和nosZ基因拷贝数进行分析。qRT-PCR分析采用荧光定量试剂盒SuperReal PreMix Plus (SYBR Green),总反应体系为20 μL,包括:10 μL的 2×SuperReal SYBR Green PreMix Plus,0.5 μL上游引物(10 μM),0.5 μL 下游引物(10 μM),5 μL的DNA模板和4 μL的ddH2O。所有基因引物合成序列信息和相应的PCR扩增程序参照之前的文献报道[12,20]。
1.6 数据分析
采用三因素方差分析检验氮添加(N),磷添加(P)与不同取样时间(D)的主效应及其交互作用对土壤理化指标及氮、磷转化功能基因拷贝数的影响。采用裂区方差分析检验每个取样时间下氮、磷添加及其交互作用对土壤理化指标及氮、磷转化功能基因拷贝数的影响,其中氮水平和磷水平作为固定因子,区组为随机因子。采用邓肯(Duncan)多重比较(P<0.05)检验氮或磷添加水平间的差异,方差分析均使用SPSS(version 19.0; IBM, Armonk, New York, USA)进行。采用冗余分析(RDA)评估不同取样时间下氮、磷转化功能基因拷贝数与土壤理化指标间的关系。数据作图采用GraphPad(version 8.0.1, GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA)进行。
2.1 氮磷添加对土壤理化性质的影响
表1 三因素方差分析氮添加(N)、磷添加(P)、取样时间(D)及其交互作用对土壤理化性质的影响Table 1 Results of multi-factor ANOVA analysis showing the effects of nitrogen addition, phosphorus addition, sampling dates and their interactions on soil properties
表2 氮添加(N)、磷添加(P)及其交互作用对不同月份土壤理化性质的影响Table 2 Results of split-plot analysis of variance showing the effects of nitrogen addition, phosphorus addition, and their interaction on soil properties in different sampling dates
氮、磷添加对土壤TC、TN含量和TC:TN比的影响不显著(表1,P>0.05),显著影响土壤TP含量、TC:TP和TN:TP(表1,P<0.01)。磷添加显著增加了TP含量(表2,P<0.001),降低了土壤TC:TP比和TN:TP比(表2,P<0.001),氮添加降低TP含量(表2,P<0.05),提高TC:TP比和TN:TP比(表2,P<0.05)。
土壤pH受到氮、磷添加交互作用的显著影响(表1,P<0.01),氮、磷单独添加均可降低土壤pH(表2,P<0.01),高氮水平下添加磷对土壤pH的降低不明显。土壤水含量(SWC)受氮、磷添加和取样时间交互作用的显著影响(表1,P<0.05),氮添加可显著降低5月份SWC,高氮水平下,磷添加可降低SWC(表2,P<0.01)。7月份SWC低于5月和8月份。
2.2 氮磷添加对土壤细菌和磷酸酶基因丰度的影响
氮、磷添加及其交互作用对土壤细菌丰度(16S rRNA)的影响不显著(表3,P>0.05),但不同取样时间16S rRNA基因丰度差异显著(表3,P<0.05),5月份16S rRNA基因丰度整体高于7、8月份(图1)。土壤磷酸酶基因(phoD)不受氮、磷添加及取样时间的影响(表3,P>0.05)。
表3 三因素方差分析氮添加(N)、磷添加(P)、取样时间(D)及其交互作用对土壤氮、磷转化功能基因表达丰度的影响Table 3 Results of multi-factor ANOVA analysis showing the effects of nitrogen addition, phosphorus addition, sampling dates and their interactions on the abundance of functional genes involved in soil N and P cycling
图1 氮磷添加对不同取样时间土壤细菌和磷酸酶基因丰度的影响Fig.1 Effects of nitrogen and phosphorus additions on the abundances of bacteria and phosphatase gene in different sampling datesN0:0 g N m-2 a-1；
N1:1.55 g N m-2 a-1；
N2:4.65 g N m-2 a-1；
N3:13.95 g N m-2 a-1；
N4:27.9 g N m-2 a-1；
P0:0 g P2O5 m-2 a-1；
P1:12 g P2O5 m-2 a-1；
P2:24 g P2O5 m-2 a-1;不同大写字母表示氮效应显著；
不同小写字母表示磷效应显著;ns,*,**,***分别代表P>0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.001
2.3 氮磷添加对土壤氨氧化功能基因丰度的影响
土壤amoA-AOA和amoA-AOB基因表达丰度对氮、磷添加及取样时间的响应不同,不同取样时间下amoA-AOA基因拷贝数均未受到氮、磷添加及其交互作用显著影响(图2,P>0.05),但5月份的amoA-AOA基因拷贝数低于7月份和8月份。amoA-AOB基因拷贝数不受取样时间的显著影响(表3,P>0.05)。氮添加可显著增加5—8月份amoA-AOB基因拷贝数(P<0.05),且8月份高氮处理(N3和N4)下的作用效果更为显著(P<0.001)(图2)。5月份N2和N3处理下,磷添加(P2)可显著降低amoA-AOB基因拷贝数。氮、磷添加对8月份amoA-AOB基因拷贝数的影响存在交互作用,高氮水平下,磷添加可降低amoA-AOB基因拷贝数(图2，P<0.05)。
土壤amoA-AOA和amoA-AOB基因表达丰度的比值(AOA:AOB)受到氮、磷添加及取样时间三者交互作用的显著影响(表3,P<0.05)。氮添加对5—8月份AOA:AOB均有显著影响(图2,P<0.01),高氮处理(N4)可显著降低AOA:AOB(图2,P<0.05)。氮、磷添加对7月和8月AOA:AOB的影响具有交互作用,低氮处理下,磷添加可降低AOA:AOB,而高氮处理下添加磷可提高AOA:AOB(图2,P<0.05)。磷添加对5月份的AOA:AOB无显著影响(图2,P>0.05),而氮添加对5月份AOA:AOB的影响呈先升高后降低的趋势。
图2 氮磷添加对不同取样时间土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌amoA基因丰度及比值的影响Fig.2 Effects of nitrogen and phosphorus additions on amoA abundance of ammonia oxidizing archaea and ammonia oxidizing bacteria and their ratios in different sampling datesAOA:AOB:土壤氨氧化古菌与氨氧化细菌的比值 the ratio of amoA-AOA to amoA-AOB
2.4 氮磷添加对土壤反硝化功能基因丰度的影响
取样时间显著影响反硝化基因nirK拷贝数(表3,P<0.001),8月份nirK拷贝数高于5月和7月份,且高氮(N3)处理的nirK拷贝数显著高于N0处理(图3,P<0.05),氮、磷添加对5月和7月份nirK拷贝数的影响不显著(图3,P>0.05)。nirS拷贝数不受氮、磷添加及取样时间的影响(图3,P>0.05)。氮、磷添加及取样时间对7月和8月份nirK:nirS的影响也不显著(图3,P>0.05),但氮、磷交互作用对5月份nirK:nirS的影响显著,高氮处理(N3)可显著降低nirK:nirS,单独磷添加可显著增加nirK:nirS,而N2处理下磷添加可显著降低nirK:nirS(图3,P<0.05)。氮、磷添加对5—8月份narG拷贝数无显著影响(图4,P>0.05),氮添加对5月和7月份nosZ拷贝数的影响不显著,N2和N3处理可显著增加8月份nosZ的拷贝数(图4,P<0.05)。
图3 氮磷添加对不同取样时间土壤反硝化功能基因nirK、nirS丰度及其比值的影响Fig.3 Effects of nitrogen and phosphorus additions on the abundances of nirK and nirS involved in denitrification and their ratios in different sampling dates
图4 氮磷添加对 取样时间土壤反硝化功能基因narG、nosZ丰度的影响Fig.4 Effects of nitrogen and phosphorus additions on the abundances of narG and nosZ involved in denitrification in different sampling dates
2.5 氮磷添加对土壤氮损失潜势的影响
土壤硝酸盐渗漏潜势(amoA:narG)受到氮、磷添加、取样时间及其交互作用的影响(表3,P<0.05)。氮添加可增加5—8月份amoA:narG,5月和7月amoA:narG受到氮磷添加交互作用的影响(图5,P<0.05)。5月份,N2、N3和N4处理下添加磷可降低amoA:narG；
7月份,N2处理下添加磷可降低amoA:narG(图5,P<0.05)。不同时间土壤气态氮损失潜势(nirK+nirS)有差异(表3,P<0.001),8月份nirK+nirS高于5月和7月份,且高氮(N3)处理的nirK+nirS显著高于N0处理(图5,P<0.05),氮、磷添加对5月和7月份的nirK+nirS影响不显著(图5,P>0.05)。
图5 氮磷添加对不同取样时间土壤氮损失潜势的影响Fig.5 Effects of nitrogen and phosphorus additions on the potential of soil N loss in different sampling dates
2.6 土壤理化性质与氨氧化和反硝化基因丰度的关系
图6 冗余分析(RDA)土壤理化性质与氨氧化和反硝化基因丰度的关系Fig.6 The redundancy analysis (RDA) showing the relationship between the soil properties and the abundance of genes involved in ammonia oxidation and denitrification土壤铵态氮 soil ammonium 土壤硝态氮 soil nitrate；
Olsen-P:土壤速效磷 soil available phosphorus；
TC:土壤总碳 soil total carbon；
TN:土壤总氮 soil total nitrogen；
TP:土壤全磷 soil total phosphorus；
TC:TN:土壤全碳与全氮的比值 the ratio of soil total carbon to soil total nitrogen；
TC:TP:土壤全碳与全磷的比值 the ratio of soil total carbon to soil total phosphorus；
TN:TP:土壤全氮与全磷的比值 the ratio of soil total nitrogen to soil total phosphorus；
SWC:土壤含水量 soil water content
3.1 土壤氨氧化和反硝化基因丰度对氮、磷添加的响应
nirK或nirS编码的亚硝酸盐还原酶催化由亚硝酸盐还原成NO的过程,是土壤中气态氮损失和N2O排放的重要途径[9]。不同的生态系统nirK和nirS基因的相对丰度不同,一些农田生态系统中,nirS基因丰度显著高于nirK基因丰度,亚硝酸盐还原过程主要是由nirS型细菌驱动[35—36]。然而,本研究中nirK基因丰度显著高于nirS基因丰度(nirK:nirS>1),这说明nirK型细菌是该生态系统亚硝酸盐还原过程的主要驱动者,其他草原生态系统中也发现nirK基因丰度高于nirS基因丰度[2, 11]。但nirK和nirS基因丰度对氮添加的响应也存在不一致性[2—3, 35]。本研究发现nirS基因丰度比较稳定,不受氮添加和取样时间的影响,nirK的丰度对氮添加的响应受到取样时间的影响,氮添加只有在8月份对nirK基因丰度具有显著的促进作用,且8月份nirK的丰度显著高于5和7月。Azziz等[37]研究表明,植物生长时期是nirS和nirK基因丰度的主要影响因素。在冬小麦田的研究中也发现,nirS和nirK基因丰度在开花期对氮磷添加的响应更明显,而在其他生长时期氮磷添加对nirS和nirK基因丰度的影响不显著[4]。土壤反硝化细菌受到许多环境因子的影响,比如碳的可利用性、土壤湿度和pH等[38]。Tang等[3]认为矿质氮含量的增加引起的土壤酸化和盐分离子的富集可能是氮添加导致nirS和nirK基因丰度降低的原因。本研究RDA的结果表明,nirK+nirS基因丰度与SWC正相关,与pH负相关(图6)。同时,8月份SWC和nirK的丰度最大,这说明在土壤湿度高的情况下可促进土壤反硝化过程。
3.2 氮、磷添加对土壤氮损失潜势的影响
3.3 土壤磷转化phoD基因丰度对氮、磷添加的响应
长期施磷肥(28年)的玉米田,土壤磷的有效性与碱性磷酸单酯酶活性、phoD基因丰度呈负相关关系,即碱性磷酸单酯酶活性受土壤有效磷的调控[22]。因此,在缺磷时碱性磷酸单酯酶活性和phoD基因丰度会增加[43—44]。然而,Ikoyi等[45]通过短期温室试验发现,phoD基因丰度与土壤有效磷之间没有显著的相关关系。本研究发现,土壤有效磷含量的变化并没有导致phoD基因丰度的改变,phoD基因丰度不受氮、磷添加的影响。这种不一致性可能与这些研究中施磷的时间和数量有关,长期施肥对土壤微生物群落结构的影响更为显著[46]。此外,Hu等[20]通过长期(10年)的有机肥处理发现,土壤中phoD基因丰度明显增加,然而,phoD与16S rRNA基因丰度的比值却在所有处理中无显著差异,这表明长期施用有机肥促进了整个土壤细菌的生长,而不仅仅是phoD型细菌的生长。本研究中氮、磷添加对16S rRNA基因的丰度也没有显著影响,这说明短期的氮、磷添加试验并不会引起呼伦贝尔草甸草原土壤phoD与16S rRNA基因丰度的改变。
本研究发现,呼伦贝尔草甸草原土壤细菌16S rRNA、磷酸酶基因phoD、氨氧化古菌amoA-AOA、反硝化基因nirS和narG丰度相对比较稳定,而反硝化基因nirK和nosZ丰度对氮添加的响应受到生长季节的调控,且与土壤含水量的变化紧密相关。土壤湿度较大时,氮添加可增加nirK丰度,提高土壤气态氮损失潜势。土壤氨氧化细菌amoA-AOB丰度受氮磷添加的共同调控,氮添加通过增加amoA-AOB基因丰度增强了土壤硝酸盐淋溶损失潜势,而高氮处理下添加磷可减小硝酸盐淋溶损失潜势。因此,磷添加对提高土壤氮的利用效率具有重要作用,但有关氮磷添加协同调控土壤氮损失的机制还需要深入探究。
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