敖茂宏，马伏宁，彭 杨，黄东梅，邢文婷，吴 斌，许 奕*
1.贵州省亚热带作物研究所，贵州兴义 562400；
2.中国热带农业科学院海口实验站/海南省香蕉遗传改良重点实验室，海南海口 571101；
3.中国热带农业科学院三亚研究院/海南省南繁生物安全与分子育种重点实验室/海南省崖州湾种子实验室，海南三亚 572000
西番莲（Passiflora eduliaSims）是原产于热带地区的藤本植物，属被子植物门双子叶植物纲西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（Passiflora），是珍稀的热带亚热带水果。果实酸甜可口，风味浓郁，芳香怡人，故有“果汁之王”美誉，其又被称为百香果。果实被誉为天然香料，是重要的高档甜点调味剂、调香剂，全株都具有药用价值，是世界上已知最芳香的水果之一，是一种极具开发前景的优质水果。因此，西番莲在热带农业中具有非常重要的地位。西番莲在国内的种植面积是7.33万hm2（农业农村部2021年数据），已超过起源地巴西（6.66万 hm2），位列世界第一。然而，其是典型的“易种难管”的热带高品质果树，“难管”的其中最重要的原因就是环境变换导致的逆境胁迫时常发生，且给产业造成毁灭性伤害，如高温导致座果率降至正常温度的10%~15%，低温致死，干旱和高盐抑制生长发育，究其根本原因就是抗性品种的缺乏，且西番莲特有的抗逆机制不清楚。因此通过对西番莲的抗逆基因资源进行挖掘，研究该基因的功能来进一步提高西番莲的抗逆性就成为一个重要的手段。
有大量的研究表明，植物细胞中的膜蛋白在植物抗逆过程中具有重要作用，水通道蛋白（aquaporin, AQP）就是其中研究较为深入和系统的一类膜蛋白。水通道蛋白是一类位于各种细胞膜上24～34 kDa的小分子跨膜蛋白，能够调节水分以及其他小分子物质的运输。植物中存在较多的水通道蛋白成员，其中拟南芥中有 35个[1]，水稻中有33个[2]，玉米中有36个[3]，香蕉中有47个[4]。根据序列同源性，AQP被分为8大亚家族，分别为质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins, PIPs）、液泡膜内在蛋白（tonoplast intrinsic proteins, TIPs）、类Nod26膜内在蛋白（nodulin 26-like intrinsic proteins, NIPs）、碱性小分子膜内在蛋白（small basic intrinsic proteins, SIPs）、GlpF样内在蛋白（GlpF-like intrinsic proteins, GIPs）、未鉴定膜内在蛋白（uncategorized members designated X intrinsic proteins, XIPs）、杂种内在蛋白（hybrid intrinsic proteins, HIPs）、大的内在蛋白（large intrinsic proteins, LIPs）[5]。这8类AQP具有高度保守结构，都有6个倾斜的右旋性跨膜结构（TM1 to TM6），并被5个环（loop）所连接。
AQP不仅在植物生长发育过程如生殖生长、种子萌发、气孔运动等方面起着重要作用[6-8]，而且能够控制植物体内的水分平衡而响应干旱、高盐和低温等各种非生物胁迫[9-11]。相关报道显示，在植物中过量表达一些 AQP家族基因能够提高转基因植物对低温胁迫的耐受性。在拟南芥中过表达MaPIP1;1能够提高其抗寒能力[12]，MaSIP2-1提高了转基因香蕉的耐寒性[9]，在烟草中转化TaAQP7提高了其耐低温的能力[13]。
综上所述，当前的研究揭示了AQP基因在提高植物抵抗非生物胁迫上起着重要的作用。目前西番莲中关于AQP基因的功能研究尚未见报道。本研究以西番莲全基因组数据为基础，在前期的转录组数据中，选取了1个受到非生物胁迫诱导表达的 AQP基因PePIP2，对其进行克隆并运用生物信息学分析其核酸序列的特征、蛋白质理化性质、蛋白结构、系统进化关系、启动子元件等信息，并对其在干旱、高盐、低温、高温胁迫诱导的表达模式进行验证和研究，通过烟草瞬时表达进一步验证了其能够响应干旱胁迫诱导表达。研究结果对于深入了解AQP基因家族功能，同时为西番莲抗逆功能基因的挖掘及抗逆育种提供理论依据。
1.1 材料
选取西番莲‘台农’嫩叶，用无菌水清洗后立即用液氮速冻放-80℃冰箱备用，西番莲取自中国热带农业科学院海口实验站种苗组培中心。pCAMBIA1304表达载体取自中国热带农业科学院海口实验站。克隆载体 pMD19-T、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、高保真酶 PrimeS-TAR®Max DNA Polymerase、实时荧光定量PCR试剂盒、T4连接酶均购自TaKaRa公司，大肠杆菌感受态（E.coliDH5α）、农杆菌感受态（EHA105）、质粒提取试剂盒和 DNA回收试剂盒购自AXY-GEN公司，DNA Marker （DL 2000）购自北京中科瑞泰公司。无缝克隆试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。其他化学药品为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA提取及 cDNA的获得 将西番莲‘台农’嫩叶用液氮研磨，按照柱式Trizol总RNA提取试剂盒说明书进行。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，将其反转录获得cDNA并置于-80℃冰箱中保存备用。
1.2.2 目的基因的获得 从西番莲基因组数据库中获得西番莲AQP家族基因PePIP2的序列，利用NCBI Primer-BLAST在线工具设计全长引物，引物序列为 PePIP2F（5＇-ATGGCAAAGGATGTG GAGACAGCAG-3＇）和 PePIP2R（5＇-CTAAACAGT TGGGTTGCTCCTGAAG-3＇），以 cDNA 为模板扩增PePIP2全长序列。PCR扩增程序为：95℃预变性 3 min；
95℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 50 s，共35个循环，72℃失活10 min。对PCR产物进行PCR产物纯化回收，连接克隆载体pMD19-T，转化E.coliDH5α感受态细胞，对长出的单克隆菌落PCR鉴定，选取几个PCR鉴定阳性的克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序分析。
1.2.3 生物信息学分析 使用 ProtParam（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）在软件线计算蛋白的等电点（pI）、分子量（Mw）和分子式。利用 Clustal X和 MEGA3软件，将PePIP2所编码的氨基酸序列与其他植物中的PIP的氨基酸序列进行了系统进化树的比对分析。利用 WoLF PSORT（https://www.genscript.com/wolfpsort.html）在线软件预测它们的亚细胞定位点。从Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）数据库获得PePIP2基因转录起始位点上游的2000 bp基因组DNA序列，用于鉴定PePIP2基因启动子区域的作用元件[14]。利用DNAMAN对各物种中的PIP2的氨基酸序列进行比对。
1.2.4 不同非生物胁迫处理及不同组织中的表达选择西番莲‘台农’品种的健康无病毒组培苗，在培养室[温度为 30℃；
光照强度为200 μmol/(m2·s)；
12 h 光照/12 h 黑暗循环；
70%相对湿度]中生长至约1 m并具有8~10个功能叶片时进行各种非生物胁迫处理。干旱胁迫处理时，停止浇水至土壤水分为 50%和 10%时进行叶片取样。高盐胁迫处理时，用300 mmol/L NaCl溶液进行浇灌幼苗分别在第3天和第10天时进行叶片取样。低温处理时，将植株在0℃下分别处理20、48 h进行叶片取样。对于高温处理时，植物在 45℃分别处理2、4、24 h进行叶片取样。进行西番莲不同组织中的表达，根、茎、叶分别取生长至1 m并具有8~10个功能叶的西番莲各幼嫩组织，花、果分别采自儋州实验基地的健康材料。对上述各样品用液氮速冻，提取RNA并反转录成cDNA。根据PePIP2全长基因序列设计荧光定量引物，qPePIP2F（5＇-AGGACTATCATGACCCACCACCA GCA-3＇）和 qPePIP2R（5＇-GCGATCCCAAGAATT CCAACACCAGC-3＇），选用西番莲EF1α为内参基因，进行qRT-PCR检测，使用2-ΔΔCT方法计算相对表达水平。
1.2.5 表达载体的构建 用添加NcoⅠ和SpeⅠ酶切位点的PePIP2全长引物扩增PePIP2-19T载体获得 PCR产物，进行纯化回收。用NcoⅠ和SpeⅠ将获得的PCR产物和pCAMBIA1304表达载体分别进行双酶切，回收片段后进行T4连接酶连接，转化大肠杆菌感受态，37℃过夜培养，将平板上的克隆进行摇菌 PCR检测，提取质粒酶切验证。
1.2.6 干旱胁迫下的烟草瞬时表达 将构建成功的 PePIP2-pCAMBIA1304载体质粒转化农杆菌感受态EHA105，进行阳性克隆验证，将验证成功的克隆摇菌保存。取1 mL农杆菌接种至50 mL YEP液体培养基中，在 28℃摇床中摇至OD600=1.0。在8000 r/min转速下，5 min离心收菌，配置含有0.2 mmol/L AS（乙酰丁香酮），10 mmol/L MgCl2，pH 5.6（KOH调pH）的10 mmol/L MES溶液，洗菌体，重悬至OD600=1.0。将重悬后的菌液室温放置3~5 h，用1 mL注射器，去掉针头，注射本氏烟草的叶片下表皮，黑暗培养48 h，切下直径为 0.5 cm的叶盘，在 25℃下漂浮在含有 18%（m/V）的PEG 6000（模拟干旱胁迫）1/2 MS液体培养基中进行 0、2、4、8、12、24、36、48 h处理，将各叶盘进行液氮冻样提取 RNA并反转录，对PePIP2基因在各处理下进行荧光定量PCR分析检测。
2.1 PePIP2基因的克隆与鉴定
以西番莲‘台农’嫩叶的cDNA为模板，用基因全长引物PePIP2F和PePIP2R进行PCR扩增，获得PePIP2的基因全长为861 bp（图1），编码286个氨基酸（图2）。
图1 PePIP2基因克隆PCR鉴定Fig.1 PCR amplification of PePIP2 gene
图2 PePIP2基因CDS区核苷酸序列及其推导氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of PePIP2 CDS region
2.2 生物信息学分析
2.2.1PePIP2编码蛋白质的理化性质分析 利用Protparam在线软件分析PePIP2的理化性质，其分子式为 C1417H2156N360O373S8，分子量为 30 459.37 Da，理论等电点（pI）为8.84。预测其定位于细胞质中。
2.2.2 氨基酸序列比对 由PePIP2推导的氨基酸序列与NCBI中已登录的其他高等植物的PIP2氨基酸序列进行同源关系的比较，结果显示，各种植物PIP2编码的氨基酸序列存在较高的同源性，多数都达到64%以上（图3）。BLASTX分析表明，PePIP2编码的氨基酸序列与银白杨PaPIP2（Populus alba），含羞草MpPIP2（Mimosa pudica），麻风树JcPIP2（Jatropha curcas），菜豆PvPIP2（Phaseolus vulgaris），雷公藤TwPIP2（Tripterygium wilfordii），雨树SsPIP2（Samanea saman）编码的氨基酸序列具有较高的一致性，分别为 84.72%、84.38%、69.58%,、69.23%、68.53%、64.11%。
图3 PePIP2氨基酸序列差异比对Fig.3 Sequence difference alignment of PePIP2 amino acid
2.2.3 PePIP2编码蛋白质的 Motif分析 利用Motif Search（http://www.genome.jp/tools/motif/）在线软件对推导的 PePIP2氨基酸序列进行生物学意义的位点分析（图4），只在 30～265位点之间预测到1个MIP结构域，位点230的氨基酸（A，丙氨酸）为主要内在蛋白。
图4 PePIP2蛋白序列Motif预测分析Fig.4 Motif prediction from deduced amino acid sequence of PePIP2
2.2.4PePIP2启动子元件分析 利用PlantCARE软件对PePIP2基因的启动子元件进行分析，结果表明该片段包含多个TATA-box和CAAT-box核心cis-acting element，其余的功能元件主要包括3个脱落酸响应元件（ABRE），1个低温响应元件（LTR），1个生长素响应元件（AuxRR-core），2个与厌氧反应相关的元件（ARE），2个与防御相关的元件（TC-rich repeats），7种类型的光响应元件（TCCC-motif, TCT-motif, ATCT-motif,Box 4, G-Box, AE-box, MRE）等（图5）。该分析表明基因的功能可能和非生物胁迫和植物发育相关。
图5 PePIP2启动子顺式作用元件Fig.5 cis-acting element of PePIP2
2.2.5 PePIP2进化树分析 利用 Clustal X和MEGA3软件，将PePIP2所编码的氨基酸序列与其他植物中的 PIP2的氨基酸序列进行系统进化树的比对分析。结果表明西番莲PePIP2与含羞草MpPIP2（Mimosa pudica），木豆 CcPIP2（Cajanus cajan），大豆GsPIP2（Glycine soja）这3个物种的同源基因具有较近的亲缘关系（图6）。
2.3 不同非生物胁迫下及在各组织中的表达分析
前期对西番莲在干旱、高盐、高温、低温胁迫进行转录组分析，其中PePIP2受到干旱、高温和低温胁迫，其转录组FPKM值如表1。本研究对其进行了qRT-PCR验证，结果表明该基因未受到高盐胁迫的诱导表达在干旱、高温和低温胁迫下均被诱导表达（图7），其中在土壤含水量为50%，在45℃高温处理4 h和0℃低温处理48 h，其表达量最高。在对其进行组织特异性的表达结果表明，PePIP2在西番莲的各个组织中均有表达，其中在根部表达量最高（图8）。
图7 不同非生物胁迫中PePIP2的表达分析Fig.7 Expression analysis of PePIP2 under different abiotic stresses
图8 PePIP2在西番莲不同组织中的表达模式Fig.8 Expression patterns of PePIP2 in different tissues of passion fruit
表1 PePIP2在非生物胁迫转录组测序中的FPKM值Tab.1 FPKM values of PePIP2 in abiotic stress transcriptome sequencing
2.4 PePIP2表达载体构建
将PePIP2基因连接表达载体pCAMBIA-1304质粒进行酶切验证，结果如图9所示，在 861 bp处有酶切的条带，与该基因大小一致。表明PePIP2已经成功连接到pCAMBIA-1304载体上。
图9 PePIP2-pCAMBIA-1304载体酶切验证图Fig.9 Picture of PePIP2-pCAMBIA-1304 vector digestion verification
2.5 干旱胁迫下烟草瞬时表达分析
将各时期干旱胁迫处理的烟草提取 RNA并反转录为cDNA，对PePIP2基因进行表达分析，结果表明在经过不同时期的干旱胁迫处理后，PePIP2均被诱导表达，呈现先升后降的趋势，其中当干旱胁迫12 h其表达量最大（图10）。
图10 瞬时表达烟草叶片不同时间干旱胁迫下PePIP2的表达Fig.10 Transient expression of PePIP2 in tobacco leaves under drought stress at different times
近年来，AQP在植物抵御非生物逆境胁迫方面的研究成为热点，相关报道显示，在植物中过量表达一些 AQP家族基因能够提高转基因植物对干旱、高盐和低温胁迫的耐受性。目前的研究表明植物AQP中的PIPs亚家族与非生物胁迫关系最为紧密。在植物中过表达OsPIP1、OsPIP2、OsPIP1、VfPIP1、BnPIP1能够增加植物对渗透胁迫或干旱胁迫的耐受性[15]。另外，香蕉MaPIP1;1的表达受到高盐胁迫诱导，能够显著提高转基因拟南芥的耐盐性[12]。拟南芥、水稻、玉米根和叶的转录组分析显示大多数水通道蛋白基因表达受低温胁迫抑制[16-17]。水稻OsPIP2;5的相对表达在长期低温处理后被显著诱导[18]。一些水通道蛋白基因的表达被证实可显著提高不同植物对非致死低温的耐受能力，如小麦TaAQ7、水稻OsPIP2;7、香蕉MusaPIP1;2、MaPIP2;7、MaPIP1;4和MaPIP2;5[19-20]。香蕉MaPIP2-7的表达受低温胁迫诱导，在香蕉中过量表达水通道蛋白基因可显著提高香蕉对低温胁迫的耐受能力[4]。本研究中对克隆到的西番莲水通道蛋白基因PePIP2在不同非生物胁迫下的表达分析表明，该基因在干旱、高温和低温胁迫下均能被不同程度上诱导表达，同时在烟草中进行瞬时表达，其在不同时间的干旱胁迫下也被诱导表达，说明该基因能响应不同的非生物胁迫。
本研究对其序列推导蛋白的氨基酸组成进行分析发现其富含丙氨酸（A）；
亲疏水性分析表明其亲水氨基酸少于疏水氨基酸，推测其蛋白为疏水蛋白；
对序列进行生物学意义位点分析发现，PePIP2的氨基酸序列上具有典型MIP结构域，符合PIP蛋白的结构特点。结果表明，PePIP2蛋白与木豆、大豆和含羞草的蛋白遗传距离最近，与万寿菊和橡胶树的遗传距离相对较远，表现为亲缘关系近的同源性较高，亲缘关系相对较远的同源性低的特点[21]。目前在香蕉等[6]植物的 PIP基因功能研究比较深入，可为西番莲PIP基因的功能提供研究方向。对该启动子元件进行分析，结果表明PePIP2基因启动子中包括响应低温、脱落酸、生长素以及光响应元件。说明该基因可能和非生物胁迫与植物生长发育过程相关。启动子对于启动基因转录和调节基因在时间和空间上的表达起了重要的作用[22]。因此，选择具有诱导型的启动子能够有效驱动基因的表达。
本研究通过同源克隆了西番莲水通道蛋白基因PePIP2的全长序列，运用生物信息学分析该基因及其编码的氨基酸序列，并根据氨基酸多重序列比对及系统进化树，启动子元件分析等推测其生物学功能，并在干旱、高盐、高温和低温等非生物胁迫下对该基因表达进行分析，结果表明PePIP2能够响应干旱、高温和低温胁迫。在烟草中进行瞬时表达进一步验证了PePIP2能够响应干旱胁迫。本研究为进一步对水通道蛋白的功能分析和表达调控奠定了基础。后续研究可将其过表达模式植物拟南芥等进行进一步研究，验证PePIP2在抗非生物胁迫中的功能。
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