王利振，盛文龙，李 宁，王荣春，刘可春
(齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所，济南 250103)
日常生活中经常会发生各种各样的意外，导致皮肤组织损伤、血管破裂、血液流出。这种情况下，需要及时对伤口进行止血，以保障受损的皮肤能够快速进行自我修复，否则极易引发伤口感染，诱发过度的炎症反应，严重者可导致截肢。因此，人们迫切需要开发高效、无毒的止血材料，能够快速封锁伤口并止血，同时有效防止细菌感染，促进伤口愈合。
壳聚糖(CS)是自然界中唯一一种正电性多糖，具有良好的止血效果。在血液中，CS结构中的—NH2可以通过静电作用与血小板结合，促进血小板粘附，加快血红细胞凝结，促进血凝块的形成[1-3]，而且，壳聚糖中正电性的—NH2可以与细胞表面负电性的生物大分子作用，堆积于细胞表面，从而改变细胞膜的通透性，影响细胞代谢，进一步起到抑制细菌增值的作用[4-6]。因此，壳聚糖被广泛应用于制备各种止血和创面修复材料中。目前，已经上市的CS类止血或创面修复材料有TraumaStat，Celox和HemCon，其中Celox的止血产品应用最广[7]。单一的CS成分应用于止血或创面修复材料中存在一定的局限性，例如，CS为线型大分子结构，普遍存在水溶性差的缺点[8]，此外，CS还存在吸水效率差、止血性能不佳、抗菌性能一般等缺点，极大地限制了其应用[9]。为了改善壳聚糖的止血及创面修复性能，提高其应用性，人们采取各种策略对壳聚糖的结构进行了改造。例如，通过取代反应在壳聚糖结构中引入季铵盐结构，以达到增加正电性官能团的数量、提高抗菌性能、改善水溶性的目的[10-11]。在壳聚糖结构中引入巯基，所得的巯基壳聚糖与血红细胞具有较好的反应性，能够有效促进血凝块的形成[12]。在壳聚糖结构中引入疏水性的烷基和多酚类化合物也可以提高壳聚糖的性能，疏水烷基可以使壳聚糖具有更好的细胞膜嵌入性，有利于血红细胞的凝结和抗菌性能的提高[13-14]。多酚类化合物可以增强壳聚糖与潮湿组织的粘附性，从而起到封闭伤口的效果，促进血红细胞凝结，加快止血速度[15-17]。结构改造的方法虽然可以提高壳聚糖的性能，但是却极易引入毒性小分子化合物，且改造后的壳聚糖降解速率下降，存在潜在的生物安全性。
通过物理共混的方式，添加其他具有止血、抗菌、促创面修复性能的高分子材料，可以实现多种材料优异性能的高度整合，获得结构层次丰富、性能优异的复合型材料[18]。而且物理共混不会改变材料的结构，不引入毒性小分子化合物，生物安全性高，有利于实际应用。γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过酰胺键连接而成的高分子聚合物，能溶于水，可降解为无毒的短肽和氨基酸[19]。γ-聚谷氨酸具有很好的粘附性、保湿性和成膜性，其结构中的羧基可以与血液中的Fe3+结合，激活凝血因子，具有一定的止血功能[20-22]。通过γ-聚谷氨酸与Ga2+进行交联反应，制备聚谷氨酸钙(PGAG)，再与CS混合凝胶化制备复合型聚谷氨酸钙—壳聚糖止血材料(PGAG-CS)，一方面可以实现两种材料不同止血机制的协同作用，提高止血性能；
另一方面还可以改善单一CS水溶性差、吸水效率差的缺点，促进创面修复。
1.1 实验仪器
真空冷冻干燥机(FD18S，山东博科)，场发射扫描电子显微镜(S-4800，日本日立)，傅里叶红外光谱仪(Bruker AV-400)，电子天平(JA2003A，上海精天电子仪器北京有限公司)，紫外可见分光光度计(UV-2600i，日本岛津)，全波长酶标仪(SPA-0093，Dynex公司)，生化培养箱(Thermo Scientific Series 8000 WJ)，台式离心机(KL04A，湖南凯达科学仪器有限公司)。
1.2 实验材料
壳聚糖(脱乙酰度95%，粘度100～200 mpa·s)，γ-聚谷氨酸(分子量70万)，氯化钙，乙酸，氯化钠，Celox止血粉，兔抗凝全血，DMEM培养基，青霉素—链霉素(双抗)，胎牛血清，二乙基二硫代氨基甲酸锌，高密度聚乙烯，噻唑蓝(MTT)，麻醉剂戊巴比妥钠。
1.3 实验动物
SD大鼠，平均体重300 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物许可证号：SCXK(鲁)20190003，山东省科学院生物研究所使用许可证编号：SYXK(鲁)20200015。
2.1 样品的制备
取γ-聚谷氨酸10 g和无水氯化钙8.4 g，加入到200 mL蒸馏水中，混合液升温至40 ℃，搅拌过夜，反应液降至室温，倒入1 000 mL无水乙醇中，析出大量白色固体，过滤，滤饼用无水乙醇洗涤，真空干燥，得PGAG。
取CS固体10 g，缓慢加入到500 mL质量分数为0.5%的乙酸水溶液中，得粘稠状凝胶溶液，加入不同质量的PGAG，继续搅拌2 h，冷冻干燥，得PGAG-CS复合材料。
2.2 红外光谱和扫描电镜分析
样品的红外光谱谱图测试采用溴化钾压片法，在JEOL型扫描电子显微镜上进行微观结构测试。
2.3 吸水率测试
精确称量样品0.2 g，用100 mL生理盐水浸泡15 min，取出后沥去多余水分，精确称量其质量，计算样品的吸水率，每个样品平行测定3次，取平均值。
2.4 凝血指数测试
将冻干的样品材料切成0.5×0.5×0.5 cm3的正方体小块，放入培养皿中，37 ℃恒温孵育5 min。吸取100 μL含有枸橼酸钠抗凝剂的兔抗凝全血滴加到样品中，再向样品中快速滴加0.02 mL浓度为0.2 mol/L的氯化钙溶液，静置5 min，加入25 mL去离子水，置于恒温培养振荡器上，在37 ℃、50 r/min的条件下，摇匀5 min；
离心，取上清液，在紫外可见分光光度计上，于545 nm处测定上清液的光密度(OD)值。空白对照组操作如下：取100 μL的兔抗凝全血，加入到25 mL去离子水中，摇匀后在545 nm波长下测定OD值。每个样品平行测定3次，取平均值。凝血指数(BCI)的计算公式如下[23]：
2.5 溶血率测试
红细胞悬浮液的制备：取含有枸橼酸钠抗凝剂的兔抗凝全血1 mL，加入到10 mL生理盐水中，摇匀，2 000 r/min离心5 min，吸出上清液，取沉淀的红细胞，重复上述步骤2次后将所得红细胞(记为质量分数100%)加入到24倍体积的生理盐水中，得质量分数为4%的红细胞悬浮液。
实验组将PGAG-CS用生理盐水配制成不同质量分数的悬浮液(2、4、6、8和10 mg/mL)。取每个质量分数的样品500 μL，加入到离心管中，加入质量分数为4%的红细胞悬浮液500 μL，37 ℃恒温孵育3 h，2 000 r/min离心15 min，取上清液100 μL加入到96孔板中，在545 nm处，使用全波长酶标仪测定OD值。同时设置阳性对照组和阴性对照组，测定其OD值。阳性对照组是将10 mL质量分数为0.1% 的聚乙二醇辛基苯基醚(tritonX-100)溶液，与200 μL质量分数为100%的红细胞悬浮液混合均匀；
阴性对照组是将500 μL的生理盐水与500 μL质量分数为4%的红细胞悬浮液混合均匀。每个样品平行测定3次，取平均值。溶血率的计算公式如下[24]：
2.6 细胞毒性测试
选取CS与PGAG质量比为10∶1的样品，测试其细胞毒性。
实验组：无菌条件下，将0.5 g样品加入到15 mL的DMEM培养基中(含1%的双抗和10%的血清)混匀，37 ℃孵育24 h，5000 r/min离心10 min，取上清液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，滤液作为质量分数为100%的浸提液。取上述浸提液，加入到不同质量分数的DMEM培养基中，配制成质量分数为75%、50%、25%的浸提液，4 ℃冰箱保存备用。
阳性对照组：取二乙基二硫代氨基甲酸锌0.5 g，按照上述步骤制备质量分数为100%的浸提液，4 ℃冰箱保存备用；
阴性对照组：取高密度聚乙烯0.5 g，按照上述步骤制备质量分数为100%的浸提液，4 ℃冰箱保存备用[25]。
L-929细胞在DMEM培养基中培养，培养温度为37 ℃，含5%的CO2。将对数生长期的细胞接种至96孔板中，每孔加入培养基100 μL，细胞密度约为105个细胞/孔，细胞培养24 h后，吸出原培养基，分别加入100 μL实验组所得的浸提液(质量分数100%、75%、50%、25%)、阳性对照组浸提液和阴性对照组浸提液。空白对照组中加入100 μL新鲜DMEM培养基(每个样品浓度设置6个平行复孔)，培养24 h后，每孔加入10 μL质量浓度为5 mg/mL的MTT(噻唑蓝)溶液，继续培养4 h，吸出原培养基，加入100 μL二甲基亚砜，避光振荡15 min，置于酶标仪上，于570 nm处测定每孔的OD值，计算细胞存活率。
2.7 大鼠股动脉止血实验
将禁食12 h的SD大鼠用0.5 mL麻醉剂(戊巴比妥钠)麻醉，固定在手术台上，用剪刀剪去大腿根部的绒毛，在腹股沟处找到股动脉，用手术刀切断后，迅速敷上PGAG-CS材料，按压30～60 s后松开，观察股动脉切口的出血状况。
2.8 促创面愈合实验
将禁食12 h的SD大鼠用0.5 mL麻醉剂麻醉，剪去大鼠背部的绒毛，左右两侧同处开一个圆形切口，直径1 cm。左侧为空白组，右侧使用PGAG-CS材料，用药后正常饲养，中途不消毒、不换药，观察第3、7、14 d伤口的愈合情况。
3.1 PGAG-CS材料的结构分析
PGAG-CS、PGAG和CS的红外光谱(FTIR)图如图1所示。在CS的红外光谱图中，1 650 cm-1处是C=O的伸缩振动峰，1 598 cm-1处是N—H的弯曲振动峰，1 087 cm-1处是C—O的伸缩振动峰，895 cm-1处是CS特有的糖环特征吸收峰。在PGAG的红外光谱图中，1 635 cm-1处是C=O的伸缩振动峰，1 586 cm-1处是N—H的弯曲振动峰，1 418 cm-1处是COO的对称伸缩振动峰。在PGAG-CS复合材料的红外光谱谱图中，1 601 cm-1处是C=O的伸缩振动峰，1 535 cm-1处为N—H的弯曲振动峰，与CS和PGAG相比，这两处峰的位置发生了明显偏移，这可能是PGAG中的羧基与CS中的氨基发生静电作用的结果。另外，在PGAG-CS复合材料的红外光谱谱图中，我们还可以看到COO—的对称伸缩振动峰(1 403 cm-1)、C—O的伸缩振动峰(1 064 cm-1)和CS特有的糖环特征吸收峰(897 cm-1)。
图1 PGAG-CS、PGAG和CS的红外光谱谱图Fig.1 FTIR Spectra of PGAG-CS、PGAG and CS
图2为不同质量比的PGAG-CS复合材料(CS:PGAG=8∶1；
10∶1；
12∶1；
14∶1；
16∶1)的扫描电镜图(SEM)，由图2可知，复合材料均为层状堆积结构，具有较多的孔隙和较大的比表面积，水分子可以大量进入到孔隙中。因此，理论上材料可以快速吸收血液中的水分，使伤口处血液中的血小板和凝血因子在材料表面快速集结，浓度瞬间提高，从而加快凝血速度。当CS和PGAG的质量比为10∶1时，层状结构最为明显，孔隙率最高。降低CS的含量(CS:PGAG=8∶1)，层状结构堆积效果变差，孔隙率明显降低，这可能是由于PGAG分子的粘附性导致的。提高CS的含量(CS:PGAG=12∶1；
14∶1；
16∶1)，层状堆积效果也会变差，这可能是由于PGAG含量降低后，与CS分子的相互作用程度降低导致的。
图2 PGAG-CS复合材料的扫描电镜图Fig.2 SEM Pictures of PGAG-CS Composite Materials
3.2 吸水率测试
测试不同质量比例的PGAG-CS复合材料的吸水率，结果如图3所示。随着材料中PGAG含量的逐渐降低，材料的吸水率逐渐升高，这是因为CS凝胶化后吸水效率变高，随着材料中CS含量的升高，吸水率相应变高。与市售的止血粉Celox相比(以壳聚糖为原料制备)，PGAG-CS复合材料具有更高的吸水效率，理论上具有更好的止血效果。
图3 PGAG-CS复合材料的吸水率测试结果Fig.3 Water Absorption Ratio of PGAG-CS Composite Materials
3.3 凝血指数测试
凝血指数(BCI)代表材料的体外凝血性能，BCI值越低，凝血效果越好，反之则凝血效果越差。我们测试了PGAG-CS复合材料在体外的BCI值，结果如图4所示。当材料中的CS与PGAG的质量比为10∶1时，BCI值最低(18.97%)，远低于市售的Celox止血粉产品(34.74%)。当升高或降低CS的含量时，BCI值均升高，说明材料的凝血效果变差，这可能与材料的层状堆积结构逐渐变差有关，比表面积的降低和孔隙的减少降低了血红细胞在材料表面的凝结效率。
图4 PGAG-CS复合材料的凝血指数测试结果Fig.4 Blood Clotting Index of PGAG-CS Composite Materials
3.4 溶血率测试
图5表示不同浓度的PGAG-CS复合材料引起血红细胞的溶血情况，很明显，随着材料质量浓度的逐渐升高(2 mg/mL→10 mg/mL)，材料的溶血率逐渐升高，但是只有当CS和PGAG的质量比为16∶1时，样品的溶血率超过5%(6.01%，质量浓度10 mg/mL)，其他样品在高质量浓度时的溶血率均低于5%。与对照品Celox相比(溶血率4.35%，质量浓度10 mg/mL)，PGAG-CS复合材料的溶血率略高(质量浓度10 mg/mL，当CS:PGAG为8∶1、10∶1、12∶1、14∶1时，溶血率分别为4.92%、4.63%、4.23%和4.66%)。图6为各个样品与血红细胞结合后的溶血情况照片，每张照片从左到右依次为：阳性对照、阴性对照，样品质量浓度为2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL。阳性对照组(tritonX-100)可以导致完全溶血，溶液为红色，阴性对照组(生理盐水)为澄清透明，无溶血现象发生，PGAG-CS材料与对照品Celox的溶液都接近澄清透明，几乎无溶血现象。
图5 PGAG-CS复合材料的溶血率测试结果Fig.5 The Hemolysis Ratio of PGAG-CS Composite Materials
图6 PGAG-CS复合材料的溶血率测试照片Fig.6 Photos of the Hemolysis Ratio of PGAG-CS Composite Materials
3.5 细胞毒性测试
综合分析，当CS与PGAG的质量比为10∶1时，材料具有最低的凝血指数、高的吸水效率和低的溶血率，因此我们选择质量比为10∶1的样品进行后续的细胞毒性测试。我们将CS与PGAG质量比为10∶1的材料溶解在DMEM培养基中制作浸提液，计为质量分数100%，并依次用DMEM培养基稀释得到质量分数为75%、50%和25%的浸提液，并以此浸提液作为培养基培养L929细胞，采用MTT法测定细胞的存活情况，同时以二乙基二硫代氨基甲酸锌(ZDEC)作为阳性对照组，高密度聚乙烯(PE)作为阴性对照组，结果如图7所示。当浸提液的质量分数为100%时，细胞的存活率为87.15%，随着浸提液质量分数的降低，细胞的存活率逐渐升高；
当浸提液的质量分数降低至25%时，细胞存活率为108.61%。阳性对照组ZDEC作用下的细胞存活率为8.90%，阴性对照组PE作用下的细胞存活率为107.15%。当市售Celox止血粉浸提液质量分数为100%时，L929细胞的存活率为79.01%，低于PGAG-CS复合材料。
图7 PGAG-CS复合材料的细胞毒性实验结果Fig.7 Cytotoxicity of the PGAG-CS Composite Materials on L929 Cells
3.6 大鼠股动脉止血实验
如图8所示，以PGAG-CS复合材料按压大鼠股动脉30 s后，材料粘附在伤口处，可达到快速止血的效果，等待3 min以上，无二次出血状况发生。在同一只大鼠身上，切断右侧腹股沟处的股动脉，迅速敷上市售的Celox止血粉，按压30 s后，有少量血液渗出，继续按压30 s后，血液渗出量变大，3 min后，出血量明显增多。上述实验结果表明，PGAG-CS的止血效果明显优于市售的Celox止血粉。
图8 PGAG-CS复合材料的大鼠股动脉止血实验Fig.8 Hemostatic Investigation of PGAG-CS on the Femoral Arterial Hemorrhage of Rats
3.7 促创面愈合实验
如图9所示，PGAG-CS材料与创面接触后具有一定的粘附性，第3 d时，创面处有少量PGAG-CS材料残余；
第7 d时，使用PGAG-CS材料的伤口直径明显小于左侧空白；
第14 d时，使用PGAG-CS材料的伤口接近愈合，而左侧空白仍然有较大面积的伤口。以上结果表明，PGAG-CS材料除具有不错的止血性能外，还对创面愈合具有一定的促进效果。
图9 PGAG-CS对大鼠创面愈合过程的影响Fig.9 Wound-Healing Investigation of PGAG-CS on Rats
以CS和PGAG为原料制备新型的复合止血材料，材料呈层状堆积结构，具有较多的孔隙和较大的比表面积，有利于血小板和凝血因子在材料表面集结。材料的吸水率均在800%以上，BCI值低于市售止血粉Celox，说明其吸水迅速，与血红细胞的结合能力较好，可有效促进血红细胞凝结。另外，PGAG-CS复合材料具有较低的溶血率(<5%)，不会使血液中的血红细胞破裂，引起溶血现象。当材料中CS与PGAG的质量比为10∶1时，材料的体外综合性能最好，细胞毒性实验结果表明材料的细胞毒性低于市售产品Celox。大鼠股动脉止血实验表明：止血材料可以在30 s内止血，且无二次出血现象，对创面愈合也有一定的促进作用。
猜你喜欢壳聚糖红细胞创面红细胞的奇妙旅行家教世界(2022年34期)2023-01-08rn-bFGH（盖扶）对创面修复的影响云南医药(2019年3期)2019-07-25创面治疗新技术的研发与转化应用系列丛书创伤外科杂志(2019年9期)2019-03-24猪附红细胞体病的发生及防治兽医导刊(2016年6期)2016-05-17壳聚糖的应用食品界(2016年4期)2016-02-27银离子敷料在治疗慢性创面中的应用西南军医(2015年6期)2015-01-23壳聚糖对尿路感染主要病原菌的体外抑制作用应用化工(2014年7期)2014-08-09中西医结合治疗大面积深度烧伤后残余创面35例中国中医药现代远程教育(2014年21期)2014-03-01碱浸处理对壳聚糖膜性质的影响应用技术学报(2014年4期)2014-02-28羊附红细胞体病的诊疗当代畜禽养殖业(2014年12期)2014-02-27