杜久斌 唐慧芬 潘晓梅 赵晓英 廖 勇 刘强德 孙彦军 贺 笋
（天康生物制药有限公司，**乌鲁木齐 830001）
猪流行性腹泻病毒（PEDV）是猪的一种高致病性接触性传染病，属于冠状病毒，1971年首次在英国被发现，随后比利时、荷兰、德国、瑞士、法国、匈牙利和保加利亚等国均有该病的报道，我国从80年代证明有猪流行性腹泻病的发生。到2000年，该病已在我国全面流行，特别是从2010年起，我国出现新的高致病性PEDV毒株[1]，导致我国免疫猪群中再度发病，给我国养猪业造成巨大的危害[2-4]，对PED的预防和防控应以疫苗接种为主，国内外的研究者在PED疫苗研究方面已做了大量工作[5,6]，但目前为止，还没有研制出特别有效的疫苗可以控制PED疾病的发生。目前市面上以PED细胞灭活疫苗和PED细胞弱毒活疫苗为主来预防PEDV[7]。在临床上使用PED灭活疫苗免疫2次后，母猪血清和乳汁中所产生的中和抗体、IgA和IgG水平，高于2针活疫苗免疫和1针活疫苗加1针灭活疫苗的免疫效果[8]。
有效的PED疫苗免疫猪只后能产生较高的中和抗体，保护猪只免受PED病毒的感染[9]。由于临床受野毒感染的影响，不能客观评价活疫苗和灭活疫苗所产生的抗体水平[10]。因此，在本研究中，选择未感染过PEDV的仔猪免疫商品化PED细胞活疫苗和灭活疫苗，综合评价不同疫苗免疫仔猪后血清的抗体反应情况。
1.1 试验材料
猪流行性腹泻病毒：猪流行性腹泻病毒（XJ-DB2株）代次F14代，病毒含量106.0 TCID50/mL，批号：20150917。
细胞：Vero细胞，购自中国兽医药品监察所，由天康生物制药公司保管、传代。
疫苗：PED细胞活疫苗、灭活疫苗均为市售疫苗。
试剂盒：猪流行性腹泻IgA抗体检测试剂盒，购自爱德士公司，批号：21028；
猪流行性腹泻IgG抗体检测试剂盒，购自Biovet Inc公司，批号：230204。
试验动物：选用PED抗原、抗体阴性妊娠母猪所产1月龄仔猪。
1.2 试验方法
1.2.1 试验分组及免疫
筛选产前15 d左右妊娠母猪运输至试验动物舍，隔离饲养。母猪分娩后仔猪母乳喂养至1月龄，将仔猪分成3组，每组5头。第Ⅰ组免疫活疫苗，10头份/头，免疫1次；
第Ⅱ组免疫灭活疫苗，2 mL/头，首次免疫完间隔14日加强免疫1次；
第Ⅲ组为空白对照组，不做免疫。试验动物分组及免疫情况见表1。
表1 实验动物分组及免疫
1.2.2 样品采集
试验猪只于首免时、一免后14日和一免后28日分别采集血清，用于抗体水平检测。
1.2.3 抗体检测
将待检血清、阳性血清和阴性对照血清56℃水浴灭活30 min。用MEM（含10 μg/mL胰酶）对灭活后的待检样品、阳性对照和阴性对照血清在96孔U型板内进行2倍（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32…1∶256稀释）系列稀释。每个稀释度4孔，每孔100 μL。用MEM（含10 μg/mL胰酶）将检验病毒稀释成病毒含量为200 TCID50/0.1 mL的病毒液。将稀释好的病毒液按每孔100 μL加到含有血清的96孔U型板中，置37℃5%CO2培养箱内中和1 h。取培养24～48 h的96孔培养板细胞，弃去培养液，将中和1 h的病毒与血清的混合物转移至96孔培养板相应的孔内，每孔100 μL，置37℃5%CO2培养箱中培养并观察5日，用Spearman Karber法计算血清中和抗体效价。按抗体检测说明书进行IgA、IgG抗体检测。
2.1 中和抗体结果
3组试验猪免疫前血清中和抗体效价均不高于1∶2，免疫后14日，活疫苗抗体效价在1∶10左右，灭活疫苗抗体效价在1∶25左右；
免疫后28日，活疫苗抗体效价在1∶8左右，灭活疫苗抗体效价在1∶180左右。具体结果见图1。
图1 不同疫苗免疫猪只后的中和抗体检查
2.2 IgA抗体结果
3组试验猪免疫前和免疫后血清IgA抗体水平均为阴性，无论是活疫苗免疫组还是灭活疫苗免疫组，血清IgA抗体水平均无升高。具体结果见图2。
图2 不同疫苗免疫猪只后IgA抗体检测结果
2.3 IgG抗体结果
活疫苗免疫组和空白对照组免疫前后IgG抗体均为阴性；
灭活疫苗免疫组免疫后14日IgG抗体S/P值在2.3左右，免疫后28日S/P值在3.0左右。具体结果见图3。
图3 不同疫苗免疫猪只后IgG抗体检测结果
对于主要在肠道上皮细胞中复制的肠病毒，局部产生的病毒特异性IgA抗体是黏膜表面初级适应性防御的最重要功能[11,12]。血清中IgG抗体反应很少参与预防大多数肠道病毒感染[11]。血清或黏膜IgA抗体水平已被用来预测疫苗的效力和个体或畜群对肠道传染病如轮状病毒感染的免疫状态。因此，PEDV血清IgA抗体检测广泛用于评估感染和疫苗对PEDV的免疫效果[13,14]。
本试验通过未感染过PEDV的猪只肌肉注射PED灭活疫苗和PED活疫苗，对产生的IgA、IgG和中和抗体进了综合评估。结果显示，活疫苗免疫猪只不能产生I-gA抗体，而IgA主要由黏膜系统产生，说明肌肉注射PED活疫苗不能使PED疫苗弱毒进入肠道的肠壁纤毛上皮细胞增殖，从而不能诱导猪肠壁黏膜产生IgA抗体。
试验前，筛选临床上PED抗原、抗体阴性猪进行PED灭活疫苗免疫试验，免疫后猪只产生了较高的IgA抗体、IgG抗体和中和抗体水平。分析原因可能是临床阴性猪只之前感染过PED野毒，感染后的B细胞免疫反应，有全身性和黏膜性PEDV IgA抗体反应，在肠系膜淋巴结和回肠中有PEDV IgA抗体记忆的B细胞[15]。这时使用灭活疫苗免疫，就能够再次激活IgA。这也是本次试验选用临床PED抗原、抗体阴性母猪，在试验动物房生产，使用生产的仔猪进行的原因。
猪流行性腹泻活疫苗和灭活疫苗肌肉接种未感染过PEDV的猪只均不能产生IgA抗体。
猪流行性腹泻活疫苗肌肉接种未感染过PEDV的猪只不能产生IgG抗体，可以产生较低水平的中和抗体。
猪流行性腹泻灭活疫苗肌肉接种未感染过PEDV的阴猪只，能产生高水平的中和抗体和高水平的IgG抗体。
从以上结论可以看出，肌肉接种未感染过PEDV的猪只，PED灭活疫苗所产生的抗体反应高于接种活疫苗所产生的抗体，从所产生的抗体水平来看，灭活疫苗的效力高于活疫苗所产生的效力。
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