苏晓梅 李静 刘淑梅 吕宏君 王施慧 侯丽霞
摘 要：为准确高效地鉴定番茄杂交种纯度，以美小红及其父母本为试验材料，从48对核心InDel标记中挑选3对在双亲中具有明显差异且条带清晰的InDel标记，对100个美小红单株进行纯度检测，并与田间调查结果相比较。结果表明，在3对分子标记检测结果中，100个杂交种单株中有98个表现为父母本双亲互补的共显性条带，2个单株表现为母本类型的条带，种子纯度为98%，上述结果与大田鉴定结果高度一致。因此，利用该方法可准确高效地检测杂交种纯度，节约检测成本，缩短检测时间。
关键词：番茄；
美小红；
杂交种；
InDel标记；
纯度鉴定
中图分类号：S641.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）06-028-04
Identification of hybrid purity of new tomato variety Meixiaohong by using InDel markers
SU Xiaomei1， LI Jing1，2， LIU Shumei1， L? Hongjun1， WANG Shihui1， HOU Lixia1
（1. Shandong Province Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetables/Shandong Branch of National Improvement Center for Vegetables/Institute of Vegetables， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， Shandong， China; 2. College of Horticulture， China Agricultural University， Beijing 100193， China）
Abstract：
In order to identify the purity of tomato hybrid seeds accurately and efficiently， Meixiaohong and their parental inbred lines were used to detect the primers polymorphism. From 48 pairs core InDel markers， 3 pairs with clear bands and significant difference in both parents were selected to identify the purity of 100 Meixiaohong individual plants， then compared with the result of field investigation. The identification results were completely consistent by 3 InDel markers. Of the 100 Meixiaohong individuals， 98 plants were amplified the codominant bands of parental inbred lines and 2 plants were amplified the same band as the female parent. Therefore， the seed purity of "Meixiaohong" reached 98%， which were highly consistent with the result obtained in the field investigation. This method can be used to identify the hybrids purity accurately and quickly， which saves the cost and time greatly.
Key words：
Tomato; Meixiaohong; Hybrid; InDel markers; Purity identification
番茄是世界上重要的蔬菜作物，每年全球总产量1.7亿t，在蔬菜作物中产量位居首位[1]。番茄种子是全球销售额最大的蔬菜作物种子，也是国际上竞争最激烈的种子产业之一。我国是番茄生产大国，产量占全球的三分之一，也是世界上最大的番茄种子市场。目前，生产中的番茄品种大多数为杂交种，然而在其制种过程中，常会由于去雄不彻底、昆虫传粉以及机械混杂等使得杂交种子纯度降低，从而影响番茄产量或品质，对生产造成一定损失。杂交种纯度作为衡量种子质量的重要指标之一，越来越受到种子生产单位和种植户的重视。生产中为保证杂交种质量，在种子销售之前需要对其纯度进行鉴定，因此，建立一种高效、准确的杂交种纯度鉴定方法至关重要[2]。
传统的杂交种纯度鉴定以田间表型调查为主。这种方法工作量大、易受种植环境影响且鉴定周期较长，往往需要经过一个完整的生长发育期，从而造成种子销售滞后，甚至会错过销售旺季。近年来，随着分子生物学的进步，以DNA为基础的分子标记技术迅猛发展，农作物杂交种纯度的室内分子标记鉴定技术得到快速发展。DNA分子标记技术已成熟应用于番茄[3]、辣椒[4]、茄子[5]、黄瓜[6]、西瓜[7]、甜瓜[8]、大白菜[9]、甘蓝[10]和萝卜[11]等多种蔬菜的杂交种纯度鉴定。
美小红是山东省农业科学院蔬菜研究所番茄课题组选育的优质櫻桃番茄新品种。2022年完成非主要农作物品种登记[GPD番茄（2022）370116]。该品种果实为亮红色卵圆形，口感好，可溶性固形物含量（w）9.5%以上，综合抗性强，适宜在黄淮海及长江以北等地区设施内推广应用。笔者选用100株美小红及其父母本作为试验材料，筛选出3对InDel多态性引物用于美小红杂交种纯度鉴定。结合田间性状调查结果，明确美小红的杂交种种子纯度。同时，建立高效稳定的番茄杂交种纯度分子鉴定技术体系，为其他番茄品种纯度的快速鉴定提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用材料为樱桃番茄美小红杂交种及其父母本。2022年2月在山东省济南市历城区唐王育苗基地育苗，其间正常管理。当番茄幼苗生长发育至6叶1心时，移至日光温室进行定植。定植后对所有单株进行编号挂牌，便于后续的分子标记鉴定和田间表型调查。
1.2 番茄基因组DNA提取
采用快速法提取番茄基因组DNA。美小红杂交种及其父母本定植后，随机选取父母本各5株，取其幼嫩叶片，获得父母本各自的混合样品进行DNA提取。对于杂交种单株，按照田间编号，取其幼嫩叶片进行DNA提取。具体操作步骤如下：将样品置于2 mL离心管中并加2粒锆珠，加入500 μL提取液（称取12.1 g Tris，28.1 g NaCl，18.6 g EDTA，加水溶解并定容至1 L），于自动研磨仪上研磨2 min，然后12 000 r·min-1离心8 min，吸取400 μL上清液至1.5 mL离心管，加等体积异丙醇（或2倍体积冰乙醇）沉淀，-20 ℃放置30 min左右，离心5 min弃上清液，加入500 μL 75%乙醇清洗后倒掉乙醇，晾干后加100 μL ddH2O溶解。所有DNA模板于-20 ℃保存备用。
1.3 InDel标记筛选
利用美小红父母本DNA对48对InDel引物[12]进行多态性筛选。PCR扩增体系总体积为10 μL：DNA模板2 μL，2×Super Taq PCR Mix 5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.25 μL，ddH2O補充至10 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32个循环；
72 ℃延伸5 min；
16 ℃保存。PCR产物检测：8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（180 V，2 h 30 min）分离PCR扩增产物。电泳结束后进行银染，观察记录扩增结果。选择父母本间扩增条带清晰、有差异且重复性好的引物，用于进一步种子纯度鉴定。
1.4 种子纯度鉴定
以100个美小红单株DNA和双亲DNA为模板，用筛选获得的特异性InDel标记进行PCR扩增，电泳检测扩增条带，计算杂交种纯度。杂交种纯度/%=具有双亲互补条带的样本数/检测的样本数×100。
1.5 田间性状调查鉴定
2022年3月底，将美小红及其父母本在日光温室定植。其中，美小红种植100株，父母本各种12株，随后进行常规的田间管理，并在番茄生长发育不同时期进行田间性状调查。在果实成熟后，针对父母本和杂交种间的主要差异性状，每隔7 d调查1次，共计调查3次，尽量避免环境因素和人为因素造成的影响。
2 结果与分析
2.1 美小红纯度鉴定的引物筛选
以美小红父母本DNA为模板，对48对InDel引物进行多态性筛选。结果显示，48对引物中，25对引物在亲本之间扩增条带不同，多态率为52.08%；
21对引物在父母本之间扩增出相同条带，没有多态性；
还有2对引物未扩增出明显条带。在25对多态性引物中，挑选不同染色体或相同染色体不同位置的在亲本间具有明显差异的3对标记InDel-145（13）、InDel-242（25）和InDel-283（33），作为杂交种纯度鉴定的引物（图1，表1）。
2.2 美小红种子纯度的InDel标记分析
利用上述筛选获得的3对标记InDel-145（13）、InDel-242（25）和InDel-283（33）对100个美小红单株进行分子标记纯度鉴定。如图2所示，标记InDel-145（图2-a）、InDel-242（图2-b）和InDel-283（图2-c）鉴定结果一致，在100个F1杂交种单株中，田间单株编号43和56的2个样本与母本（P1）带型一样，其余98个单株均为与父母本双亲互补的杂合带型，表明该杂交种纯度为98%。
2.3 田间农艺性状调查
在田间进行农艺性状鉴定时，需要选择在亲本及杂交种中具有明显差异的且不易受环境影响的性状进行区分鉴定。调查中发现，相对于父本和美小红杂交种，母本果实圆形，节间短，叶色深绿，叶裂深，此性状可用于区分父母本和杂交种。调查上述100个美小红单株发现98株农艺性状一致，果实表现为亮红色卵圆形，而编号43和56的2个单株性状与母本高度一致，果实为圆形。因此，田间调查显示美小红的种子纯度为98%，该结果与3对InDel标记鉴定结果吻合。
3 讨论与结论
随着我国番茄种子市场的规范化管理，番茄种子品质也大幅提升。种子纯度是种子质量的重要指标之一，种子纯度鉴定是种子生产销售工作中不可缺少的重要步骤。高效准确的杂交种纯度检测方法对进一步提高种子质量具有重要意义。近年来，以DNA为基础的分子标记技术迅速发展，为农作物品种纯度鉴定提供了新的技术手段。在DNA分子标记技术中，InDel标记由于其多态性高、变异稳定且检测容易等优点，在种质资源亲缘关系鉴定及杂交种纯度鉴定等方面具有明显的优势[13-15]。笔者选用的48对InDel标记均匀分布于番茄12条染色体上，被制定为番茄品种鉴定行业标准，已应用于番茄种质资源的遗传多样性分析及番茄品种真实性鉴定[16]。研究表明，使用2～4对多态性标记进行杂交种纯度鉴定，可以避免因单引物选择不当或其他异源杂种造成的误差，从而提高检测的准确性[4，17]。在本研究筛选的多态性引物中，虽然第28、29、30、31号引物均在亲本间表现多态且条带清晰稳定，但由于它们均位于11号染色体上，且遗传连锁较为紧密，因此在本试验中并没有选择这些标记进行种子纯度鉴定。而InDel-242（25）和InDel-283（33）标记同样位于11号染色体上，但其遗传距离较远，可以避免由标记连锁而导致的鉴定结果相同，从而提高结果的准确性。
利用InDel分子标记技术进行番茄杂交种的纯度鉴定，可以替代田间形态学性状鉴定法，具有较高的可信度。选用多态性好且稳定的核心标记有利于提高筛选效率，降低成本。本研究结果显示，48对标记双亲间多态性可达到52.08%，具有多态性高、稳定性好的特点，有利于杂交种的纯度鉴定。笔者选用InDel-145（13）、InDel-242（25）和InDel-283（33）标记对100个美小红单株进行纯度检测，最終结果与田间形态鉴定结果一致。因此，这3对标记适于樱桃番茄美小红杂交种纯度鉴定，可为其杂交种生产应用提供科学依据。
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