林智城, 李佳男, 汪宏涛, 徐 娟, 唐晓凤
(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)
番茄(Solanumlycopersicum)是全球第一大经济作物[1],其营养丰富、口感良好以及含有多种天然的维生素、矿物元素和纤维素,在国民经济发展和蔬菜供给中占有不可或缺的地位。番茄还是植物特别是浆果类遗传、进化、生殖生物学和分子生物学研究的模式植物[2-7]。番茄属于呼吸跃变型果蔬,而且其水份含量高、鲜嫩皮薄、极易损伤,给贮运带来许多不便,在贮藏期间也易受疫病、软腐病、实腐病、溃疡病等多种病害的影响或侵染,极易导致霉变腐败,因此,番茄的贮藏品质显得尤为重要。番茄果实硬度是果实品质构成要素之一,与采后贮藏特性有密切关系,因此保持番茄果实硬度是提高番茄货架寿命的有效途径之一[8]。
番茄果实在贮藏过程中可能会遭遇各种各样的病原微生物,而植物在与病原微生物的攻防协同进化中形成了复杂的防御机制,包括对病原微生物的感知、信号转导、抗病基因表达,最终激活抗病相关酶,合成防卫次生代谢物[9-11]。如过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶等,在植物受到病原菌侵袭时表达量升高、活性增强,参与活性氧清除和酚类等抗病代谢物质的合成,以增强植物对病害的防御能力[12]。
紫外线抗性位点8(UV resistance locus 8,UVR8)蛋白负责UV-B感知和信号转导。UVR8基因首次在紫外敏感植物的突变筛选中被发现,该突变体对UV-B辐射敏感。突变体uvr8的UV-B抵抗能力被破坏是由于UV诱导的涉及UV损伤修复和UV保护的防御基因表达失败造成的,例如查尔酮合酶基因,它是吸收紫外线的类黄酮和花色苷生物合成的重要酶。目前,关于UVR8在植物体内的生理功能主要集中在拟南芥的研究中,包括抑制下胚轴的生长、叶肉细胞和表皮细胞的伸展、表皮气孔放大、调节生物节律、提高光合速率和提高对灰霉菌的抗性,其他植物可能还有许多未知的功能[13-17]。目前认为UVR8还参与调控其他的生理反应,包括向光性、热形态发生、昼夜节律、生长素信号、防御、耐盐、避荫、叶绿体发育、气孔开放、叶片发育和叶片向下卷曲等[18]。
本研究以UVR8转基因番茄植株果实为实验材料,野生型AC(WT)为对照,对其功能进行分析,发现UVR8能调控番茄果实的硬度,改变番茄果实的贮藏期,进一步分析发现其影响番茄果实中CAT、POD的酶活性,提高番茄果实的抗病能力,为提高番茄果实的货架寿命及其采后商品化提供理论依据。
1.1 番茄材料
野生型(WT)、UVR8过表达(UVR8-OE)和UVR8基因沉默(UVR8-Ri)番茄种子,2种突变的基因型番茄种子均由本实验室前期研究获得[19]。种子催芽并露白后播种于50孔育苗盘(装有湿润育苗土)中,在16 h/8 h(光/暗)条件下发芽和育苗。待4片真叶展开时,将小苗移栽植于标准聚碳酸酯日光温室中生长。
1.2 UVR8转基因番茄阳性植株的鉴定
在遗传转化时将筛选标记基因新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ)转入植物基因组中。以筛选标记基因设计引物NPTⅡ-F/R见表1所列,野生型番茄基因组DNA为负对照、pBI121质粒为阳性对照,进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增,以初步鉴定阳性转基因植株。
表1 本研究所用引物序列
1.3 番茄硬度检测
在番茄红熟期(red ripe,RR)时取样,WT、UVR8-OE和UVR8-Ri果实硬度用质构仪(Model TA.XT Plus,SMSTA,UK)带探头(Model SMS P/2N)进行分析。用0.005 N的起始压力并以1.50 mm/s速度压入15 mm,硬度值取每次测量最大值。对每个番茄的赤道面3点进行测定,3个生物学重复。
1.4 贮藏期分析
在番茄红熟期(RR)时取样,将WT、UVR8-OE和UVR8-Ri果实统一放置在保鲜盒中,于25 ℃烘箱中恒温贮藏,每隔5 d进行观察和拍照。
1.5 转基因番茄果实中CAT、POD酶活的测定
粗酶提取液的制备。取少量番茄外果肉,于研钵中加入液氮充分研磨成粉末,每次只取约0.3 g粉末,用1 mL冰上预冷的PBS缓冲液(0.1 mol/LKH2PO4、0.1 mol/L Na2HPO4、pH值7.0,加入1% TritonX-100、5%PVPP、5 mmol/L EDTA),充分混匀,于4 ℃离心机中13 000 r/min离心20 min。吸取上清液,再用上述的PBS缓冲液稀释3倍,即粗酶液,于4 ℃保存备用。
(1)CAT量的测定[22-23]。吸取30 μL粗酶液,加入240 μL的0.05 mol/L PBS缓冲液,混匀后置于酶标板中。迅速加入30 μL的0.1 mol/L的过氧化氢溶液,震荡5 s后立即测定240 nm吸光度,每隔30 s再测量1次A240,连续测量10次。每g番茄中CAT物质的量的计算公式为:
其中:ΔA240/t为吸光值的变化斜率,ΔA240为变化值,t为时间;Vt为提取酶液体积;Vs为反应体系中提取液体积;m为番茄样品质量。
(2)POD量的测定[22,24]。吸取60 μL粗酶液,加入210 μL0.3%愈创木酚,30 ℃孵育10 min。加入0.1 mol/L过氧化氢溶液,震荡5 s后立即测定470 nm吸光度。每隔30 s再测量1次A470,连续测量10次。每g番茄中POD物质的量的计算公式为:
(1)株洲段河岸沉积物中的重金属含量变化均较大，且自主城区入河口到出城口处沉积物重金属元素含量变化的稳定性明显降低；
沉积物中明显富集Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Pb等重金属元素，自市域河流上段 → 下段，其富集程度明显加深．
其中:ΔA470/t为吸光值的变化斜率,ΔA470为变化值,t为时间;Vt为提取酶液体积;Vs为反应体系中提取液体积;m为番茄样品质量。
1.6 转基因番茄果实中MDA量的测定
MDA量的测定[22,25]。吸取300 μL粗酶液,加入0.5 mL的0.5%TBA溶液(0.5%硫代巴比妥酸、10%三氯乙酸),95 ℃加热20 min后迅速冰浴5 min,然后4 ℃、1 000g离心10 min。取300 μL上清液于酶标板中,检测450、532、600 nm吸光度。每g番茄中MDA物质的量的计算公式为:
其中:Vt为提取酶液体积;Vs为反应体系中提取液体积;m为番茄样品质量。
各实验重复3次。测定数据利用SPSS进行统计分析。
2.1 UVR8转基因番茄植株的鉴定
分别提取WT、UVR8-OE和UVR8-Ri植株的基因组DNA,以筛选标记基因NPTⅡ特异引物进行实时定量PCR扩增。结果显示,转入基因的番茄植株扩增得到与正对照相同的预期条带约750 bp,而WT未有扩增条带如图1所示,图1表明已获得转基因阳性番茄植株。图1中,M表示DNA Marker;P表示pBI121质粒,阳性对照;1～5分别表示UVR8转基因番茄植株;N表示WT番茄,阴性对照。
图1 UVR8转基因植株基因组DNA阳性鉴定
进一步提取WT、UVR8-OE和UVR8-Ri阳性植株RNA,反转录后进行实时定量PCR。UVR8表达水平如图2所示,图2中，*表示与WT相比有显著性差异(P<0.05)。
由图2可知,分别获得UVR8表达水平高于和低于WT的2个独立的UVR8-OE和UVR8-Ri植株,分别命名为UVR8-OE1、UVR8-OE2和UVR8-Ri1、UVR8-Ri2。鉴定结果表明,植物表达载体插入片段已在番茄基因组中整合,并获得UVR8基因上调和下调表达的转基因番茄植株。
图2 UVR8转基因植株PCR分析
2.2 红熟期番茄果实硬度的比较
番茄果实硬度是果实品质构成要素之一,与采后贮运藏特性有密切关系,番茄果实的硬度测定结果如图3所示,图3中：相同字母表示没有显著性差异;不同字母表示有显著性差异(P<0.05)。
由图3可知,与WT相比,UVR8-OE番茄果实的硬度显著增加,UVR8-Ri番茄果实的硬度显著降低,说明UVR8基因表达水平的提高可以显著提高番茄果实的硬度。
图3 番茄果实硬度比较
2.3 红熟期番茄果实贮藏期的比较
因为UVR8-OE转基因番茄的硬度明显强于野生型,所以对转基因番茄果实的贮藏期进行探究。在对番茄果实的贮藏期进行比较时，发现UVR8-OE番茄果实较WT腐败速度延缓。番茄果实的自然腐败情形如图4所示。
图4 番茄果实的自然腐败情形
从图4可以看出，同日采摘的WT、UVR8-OE和UVR8-Ri番茄果实放置于25 ℃恒温烘箱中,存放15 d后,UVR8-Ri和WT番茄相继出现软化腐败,而UVR8-OE番茄品质完好。
2.4 番茄果实酶活测定
为了探究其中可能存在的其他原因,对WT、UVR8-OE和UVR8-Ri株系果实中的CAT、POD和MDA酶活进行测定。
2.4.1 CAT、POD酶活的测定
当植物受到外界不良环境的胁迫以及病原菌侵袭时,体内会产生并积累大量的活性氧[26]。植物通过激活清除活性氧的关键酶,例如CAT、POD,两者协同配合,使植物体内的氧自由基始终维持在一个相对较低的水平,以此减轻活性氧对细胞膜的氧化损害,保护植物内部细胞结构,从而延长果实的贮藏期。番茄果实酶活测定的结果如图5所示。图5中：相同字母表示没有显著性差异,不同字母表示有显著性差异(P<0.05)。
图5 UVR8转基因番茄果实中CAT、POD的量
从图5可以看出,与WT相比,UVR8-OE番茄果实中CAT、POD的活力显著提高,其中UVR8-OE番茄果实的CAT酶活是WT的2.5倍,POD酶活是WT的2.3倍;UVR8-Ri番茄果实中CAT、POD的活力显著降低,仅为WT酶活水平的1/2,这说明UVR8基因表达水平的提高可以增强防御CAT、POD的酶活性。
2.4.2 MDA量的测定
以MDA的含量作为判断植物细胞损失程度及抗病、抗胁迫能力的指标[27]。MDA含量越高,说明细胞损失程度越高,抗胁迫的能力越弱。每g番茄果实中MDA物质的量如图6所示。图6中：相同字母表示没有显著性差异；
不同字母表示有显著性差异(P<0.05)。从图6可以看出,与WT相比,UVR8-OE番茄果实中MDA的量有所降低,仅为WT的1/2,而且UVR8-Ri番茄果实中MDA的量显著提高,说明UVR8基因表达水平的提高可以降低膜系统的损伤,从而提升番茄的耐贮藏品质。
图6 UVR8转基因番茄果实中MDA的量
番茄果实硬度是果实品质构成要素之一,与采后贮藏特性有密切关系。在对UVR8转基因番茄果实的硬度进行测定时发现,UVR8-OE番茄果实的硬度显著高于野生型,而且UVR8-Ri番茄果实的硬度显著下降,表明UVR8基因参与了果实硬度形成这一重要的生理过程。在对番茄贮藏期的研究中发现,UVR8-OE番茄果实有比野生型更长的贮藏期,说明UVR8基因的过量表达能够显著提升番茄的贮藏品质,为番茄的品质改良提供了重要的理论依据。
CAT可以将过氧化氢分解为水和氧气,使植物体免受过氧化氢的伤害[28-30]。POD作为植物体内重要的呼吸酶类,它的活性高低直接影响了酚类物质的代谢,并且与病原微生物的抗性密切相关,是反映植物抗性的一个重要指标[31]，它们均对植物起着重要的逆境保护作用。在UVR8-OE番茄果实中CAT、POD活性与WT相比均显著提高。相应地,作为植物体内膜脂过氧化物重要产物之一,同时也是膜系统损伤程度、植物抗逆性重要反映指标的MDA[32-33],其在UVR8-OE番茄果实中有所降低。结果表明，UVR8可能通过促进抗病相关基因的转录表达,最终使防御酶活性增强,在宿主保护、抑制病原微生物生长中发挥作用。
本研究从表型(耐贮藏及硬度)和果实酶活的测定证实了UVR8基因在提高番茄果实的货架寿命中的作用,后续将通过对UVR8转基因番茄植株的进一步扩繁,进行较大规模植物叶片、果实病原菌接种实验,并对UVR8-OE植株中激活的下游基因进行分析,将有助于对UVR8基因功能的深入了解。
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